石墨烯量子點在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：進(jìn)展與挑戰(zhàn)

趙賢賢，陳 菲 綜述，羅 陽 審校

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，重慶 400038；2.重慶醫(yī)科大學(xué)第五臨床學(xué)院，重慶 402160；3.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400045)

羅陽

石墨烯是純碳原子的六元環(huán)平面結(jié)構(gòu)構(gòu)成的二維材料，具有比表面積大、楊氏模量和光學(xué)透過率高、導(dǎo)熱性和導(dǎo)電性好等特點[1]。石墨烯量子點(graphene quantum dots，GQDs)作為石墨烯家族的新成員，是由小的石墨烯碎片(通常為3～20 nm)組成的新型零維度碳基納米材料[2]，不僅具有石墨烯的特性，還具有量子點典型的量子限域效應(yīng)、邊緣效應(yīng)和量子隧道效應(yīng)[3]。因此,在光子學(xué)、復(fù)合材料、能源和電子學(xué)等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是在診斷、藥物釋放、近紅外(NIR)光熱療法、活體生物體內(nèi)外成像方面，GQDs展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景。

1 GQDs在體外檢測中的相關(guān)應(yīng)用

1.1以GQDs為基礎(chǔ)的免疫學(xué)分析 免疫傳感器通過結(jié)合高靈敏的傳感技術(shù)與特異性免疫反應(yīng)以監(jiān)測抗原抗體反應(yīng)，具有快速、靈敏、選擇性高、操作簡便等特點，在生物標(biāo)志物檢測等方面得到廣泛應(yīng)用[4]。根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)的類型，免疫傳感器可分為電化學(xué)式免疫傳感器、電流式免疫傳感器、壓電式免疫傳感器等。經(jīng)典免疫傳感器是將抗體或抗原固定在大分子結(jié)構(gòu)的膜或金屬電極上，當(dāng)被固定的抗體或抗原與相應(yīng)的配體結(jié)合時則可將待測物質(zhì)的濃度信號轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)輸出信號[5-6]。其中，抗原抗體固定材料的選擇決定了反應(yīng)過程中抗原抗體是否會脫落，是傳感器成功與否的關(guān)鍵。石墨烯優(yōu)良的物理特性使其成為制造各種免疫傳感器的優(yōu)秀材料[7]。以下筆者將分別介紹GQDs在電化學(xué)式、電流式免疫傳感器這兩種應(yīng)用最廣泛的免疫傳感器中的應(yīng)用。

1.1.1電化學(xué)免疫傳感器 近年來，電化學(xué)免疫傳感器因為整合了免標(biāo)記和抗原抗體相互作用的優(yōu)勢，使得檢測體系中任何能潛在反映特定蛋白質(zhì)或肽存在的變化都能被測定，而獲得越來越多的關(guān)注[8]。研究人員通過在含氮的石墨烯量子點(N-GQDs)負(fù)載PtPd構(gòu)建了雙金屬納米粒子(PtPd/N-GQDs)，基于此建立了能夠用于癌胚抗原(CEA)檢測的超敏傳感器。該傳感器在檢測CEA時展現(xiàn)出5 fg/mL 到 50 ng/mL的動態(tài)響應(yīng)范圍，檢測下限為2 fg/mL，具有超高的檢測靈敏度[9]。同時，BHATNAGAR等[10]設(shè)計了一種基于GQD-GQD之間熒光共振能量轉(zhuǎn)移的生物傳感器以用于檢測心肌肌鈣蛋白I (cTnI)，與傳統(tǒng)檢測方法相比，該傳感器表現(xiàn)出更高的特異性、更低的檢測下限(0.192 pg/mL)以及更少的檢測時間(10 min) 。他們在另一項研究中使用石墨烯量子點聚酰胺(GQD-PAMAM)納米復(fù)合物修飾金絲網(wǎng)印刷電極的傳感器中也得到了類似的結(jié)果[11]。

1.1.2電流式免疫傳感器 與其他類型免疫傳感器相比，電流式免疫傳感器由于其微型性、穩(wěn)定性、高成本效率和易于制造等特性收獲了更廣泛的關(guān)注。HUANG等[12]研發(fā)了一種簡單的基于二氧化鈦-石墨烯、以及殼聚糖和金納米粒子(AuNPs)復(fù)合膜修飾的玻碳電極的免疫傳感器，用于血液樣本中甲胎蛋白(AFP)定量檢測，該方法通過靜電吸附帶負(fù)電荷的殼聚糖/二氧化鈦-GQD復(fù)合膜，然后用固定的AFP抗體來檢測AFP含量，應(yīng)用該方法得到了一個比傳統(tǒng)檢測方法范圍更廣的檢測范圍(0.1～300.0 ng/mL)。電流式免疫傳感器的研究與電化學(xué)免疫傳感器有許多相似之處，通過GQDs的引入可極大改善所構(gòu)建檢測體系的檢測效能。

1.2以GQDs為基礎(chǔ)的核酸檢測 基于GQDs的電化學(xué)生物傳感器為核酸檢測提供了一個簡單、準(zhǔn)確、經(jīng)濟的檢測平臺，并且能夠改善單鏈DNA(ssDNA)探針序列在各種電極基板上的固定作用[13-14]，被廣泛應(yīng)用于各種核酸分析中。QIAN等[15]利用GQDs優(yōu)良的生物相容性和強大的熒光性能、DNA堿基特異性配對特性以及GQDs與碳納米管之間的熒光共振轉(zhuǎn)移構(gòu)建了一種能夠?qū)崿F(xiàn)低濃度DNA分析的方法。HU等[16]在黃金電極表面雜交捕獲探針，利用在雙鏈DNA結(jié)構(gòu)(NH2-DNA)上組裝的活性羧基群能夠被DNA識別而構(gòu)建了檢測miRNA-155的電化學(xué)體系，其中GQDs被用于通過非共價組裝實現(xiàn)過氧化物酶的固定，隨著GQDs和酶催化的結(jié)合，該生物傳感器可以檢測1 fM～100 pM濃度范圍的miRNA-155。目前，提高DNA和RNA傳感器的靈敏度和選擇性是推動GQDs應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵。

2 GQDs在體內(nèi)成像中的應(yīng)用

GQDs具有摩爾消光系數(shù)高、發(fā)射光譜窄、熒光穩(wěn)定性強以及生物相容性高等特性。因此，在生物醫(yī)學(xué)成像中也得到了廣泛應(yīng)用[17-18]。與傳統(tǒng)的成像材料相比，GQDs具有高度穩(wěn)定性和熒光強度，成像時僅僅需要少量的GQDs即可產(chǎn)生可檢測的光信號。因此，應(yīng)用GQDs作為體內(nèi)成像的造影劑，一直受到較高關(guān)注和期望。與此同時，在深層組織成像方面，NIR發(fā)射窗因其組織吸收程度較低，在超過650 nm波長范圍時光散射率降低等有利條件使其在生物醫(yī)學(xué)成像應(yīng)用方面有巨大的優(yōu)勢，因此，具有NIR反射發(fā)射特性的GQDs成為更深層組織樣本成像的候選對象[19]。有報道基于GQDs 的NIR分析儀可檢測活體細(xì)胞中抗壞血酸(AA)含量，其中提到了GQDs具有良好的雙光子熒光特性，并通過構(gòu)建雙光子納米孔實現(xiàn)了檢測活體細(xì)胞內(nèi)源性抗壞血酸和生物成像。在這個納米系統(tǒng)中，GQDs NIR分析儀在活體系統(tǒng)中表現(xiàn)出較低的熒光背景，極大提高了熒光成像分辨率[20]。由于活體細(xì)胞成像研究的快速發(fā)展，雜原子摻雜GQDs受到越來越多的關(guān)注。雜原子摻雜GQDs是調(diào)整帶隙、優(yōu)化GQDs電子密度和化學(xué)活動的有效方式，賦予雜原子摻雜的GQDs特殊光學(xué)效應(yīng)。KUO等[21]合成一種氮摻雜GQDs(N-GQDs)用于光動力學(xué)抗菌劑治療和生物成像，結(jié)果表明NIR光譜區(qū)域含氮GQDs具有優(yōu)秀的內(nèi)在發(fā)光特性和高光穩(wěn)定性，使其在追蹤細(xì)菌成像方面具有廣泛的應(yīng)用前景。CHEN等[22]則報道一種量子點修飾的石墨烯材料能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤成像、追蹤以及藥物釋放的監(jiān)控。

3 GQDs的疾病治療相關(guān)應(yīng)用

3.1GQDs作為藥物載體 為提高藥物在水中的溶解度以及靶向能力，科學(xué)家們已經(jīng)開發(fā)出了多種納米材料。多功能GQDs在癌癥治療中發(fā)揮著重要作用，既可以用作藥物載體，也可以用于可視化藥物輸送系統(tǒng)以了解細(xì)胞內(nèi)的吸收情況，能夠在不使用外部染料且不需要考慮GQDs固有熒光的情況下實時監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)的藥物輸送情況[23]。研究結(jié)果表明，合成的葉酸(FA)共軛GQDs可以用來負(fù)載宮頸癌治療藥物——阿霉素(DOX)，這一納米裝配技術(shù)可以高準(zhǔn)確性地將癌細(xì)胞從正常細(xì)胞中區(qū)分出來并有效地將藥物輸送到靶細(xì)胞。GQDs穩(wěn)定的固有熒光可以實時監(jiān)測細(xì)胞對DOX-GQD-FA的吸收，以及隨之發(fā)生的藥物釋放，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，子宮頸癌傳代細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)迅速地被內(nèi)化，整個過程中藥物釋放和積累時間延長。在體外毒性方面，DOX-GQD-FA的納米結(jié)構(gòu)可以對靶向的HeLa細(xì)胞和非靶細(xì)胞產(chǎn)生不同的效果，從而能夠顯著降低對非靶向細(xì)胞的毒性[24]。同時，基于GQDs標(biāo)記的受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用預(yù)示著一種更準(zhǔn)確、更有選擇性的癌癥診斷方法。此外，有研究表明一種多模式工具混合納米體系可用于癌細(xì)胞成像和癌癥治療，在光動力增強生物氧化還原療法和光熱療法中，GQDs常被用作多功能的納米載體來負(fù)載釓卟啉和镥卟啉兩種光敏抗癌藥物，以及在腫瘤治療過程中能顯示腫瘤反應(yīng)的深紅色熒光，同時，也能夠在增強MRI中成像[25]。GQDs可以通過其獨特的兩面和邊緣結(jié)構(gòu)來提高藥物的裝載能力，KHODADADEI等[26]合成了10 nm大小的含氮GQDs(N-GQDs)和10層石墨負(fù)載甲氨蝶呤(MTX)來構(gòu)建出一個藥物輸送系統(tǒng)，結(jié)果顯示GQDs作為納米載體可以延長藥物的靶細(xì)胞毒性作用，因而具有更強的抗腫瘤細(xì)胞活性。

3.2GQDs在疾病光治療中的應(yīng)用 光療是癌癥治療中一種比較有前景的治療方法，與傳統(tǒng)外科手術(shù)以及放化療對患者機體正常組織細(xì)胞損傷不同，光療能夠顯著減少腫瘤藥物的全身毒性，并能提高放化療治療效果。光療包括光動力療法和光熱療法，光熱療法是利用有較高光熱轉(zhuǎn)換效率的材料，在其被注入體內(nèi)后，能夠靶向聚集在腫瘤組織部位，此時當(dāng)其被特定波長的光(一般是NIR)照射后能夠?qū)⒐庾愚D(zhuǎn)化為氧自由基，作用于周圍腫瘤細(xì)胞并導(dǎo)致其消融，從而達(dá)到清除癌細(xì)胞的目的[27]。第1代和第2代光敏劑主要包括貴金屬納米顆粒和碳納米管，其中無機量子點CdSe和CdTe已應(yīng)用于臨床，GQDs因有較大的光熱轉(zhuǎn)換面積、較高的靶向性以及在NIR區(qū)高效的光熱轉(zhuǎn)換能力而成為目前研究熱點。ISAKOVIC等[28]通過電化學(xué)方法制備粒徑3～7 nm的GQDs，發(fā)現(xiàn)這種量子點在進(jìn)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞后能夠在470 nm波長的光照下殺死膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

3.3GQDs在殺菌中的應(yīng)用 羅陽團(tuán)隊報道納米級氧化石墨烯能夠通過物理方式殺菌，為清除超級細(xì)菌，解決日益嚴(yán)峻的細(xì)菌耐藥難題提供了新的方法[29]，盡管石墨烯殺菌的研究十分火熱，但是關(guān)于GQDs殺菌的報道并不多[30]。胡超[31]以GQDs和銀氨溶液為原料，通過原位還原法制備了GQDs-Ag復(fù)合納米材料，并發(fā)現(xiàn)GQDs-Ag能夠抑制大腸桿菌的生長，阻礙禾谷鐮刀菌孢子的萌發(fā)，對細(xì)菌和真菌都具有良好的抗菌性能，該復(fù)合物最低抑菌濃度在10 μg/mL。上述實驗說明GQDs具有協(xié)同殺菌效果，但是單獨的GQDs殺菌的研究仍未見報道。

4 GQDs材料的毒性

GQDs納米材料的毒性是其在生物技術(shù)應(yīng)用中面臨的主要挑戰(zhàn)之一。一項關(guān)于石墨烯材料細(xì)胞毒性的研究表明，小于50 nm的GQDs對細(xì)胞沒有明顯的毒性[32]。盡管大多數(shù)單一劑量實驗顯示GQDs納米材料沒有明顯的積累而是呈現(xiàn)出低毒性，但其體內(nèi)毒性研究需要采用模擬臨床藥物管理的多劑量試驗，以進(jìn)一步研究GQDs的生物安全性。NURUNNABI等[33]對羥基化的GQDs進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性研究，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性。PENG等[34]發(fā)現(xiàn)濃度為40 μg/mL的納米級石墨烯氧化物不會對HeLa細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的急性細(xì)胞毒性反應(yīng)。LI等[35]觀察到，在高達(dá)100 μg/mL的氧化石墨烯納米顆粒劑量下培育胃癌細(xì)胞和皮膚細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞死亡。由于DNA損傷、變異和癌癥之間存在密切的相關(guān)性，因此，在GQDs的細(xì)胞毒性研究中，評估其對DNA潛在損傷意義重大。在WANG等[36]通過對DNA損傷相關(guān)蛋白激活的流式細(xì)胞學(xué)分析，以及GQDs用于治療時對NIH-3 T3細(xì)胞的細(xì)胞吸收、細(xì)胞死亡和細(xì)胞增殖的研究，探討了GQDs對NIH-3 T3細(xì)胞的基因毒性，其中GQDs誘導(dǎo)的活性氧(ROS)生成則被確定為DNA損傷的潛在原因。YUAN等[37]研究了3個不同的官能團(tuán)[NH2,COOH,CO-N(CH3)2]修飾后的GQDs的細(xì)胞分布，并與A549和C6細(xì)胞中的細(xì)胞毒性比較。結(jié)果表明，與不同的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行耦合改性后，GQDs仍然具有良好的生物相容性和較低的細(xì)胞毒性，這使得它們在生物成像和其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面將更前景[37]。

此外，MARKOVIC等[38]分析了GQDs介導(dǎo)光動力細(xì)胞毒性的分子機制，結(jié)果顯示體外氧化應(yīng)激產(chǎn)生了光動力細(xì)胞毒性，并引起細(xì)胞凋亡和程序性死亡。然而在乳腺癌研究中卻顯示GQDs是非毒性物質(zhì)，GQDs可以迅速進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并且不干擾細(xì)胞增殖[39]。因此，GQDs的細(xì)胞毒性仍需進(jìn)一步研究，通過不斷探索GQDs的安全性，為其大規(guī)模臨床使用奠定基礎(chǔ)。

5 結(jié)論與展望

隨著GQDs合成方法的不斷改進(jìn)和革新，各種性能優(yōu)良的GQDs被逐漸報道。由于尺寸和形狀對GQDs的物理化學(xué)性質(zhì)有巨大的影響，因此，如果基于GQDs的熒光檢測方法想要逐漸取代傳統(tǒng)的實驗室檢測技術(shù)，仍需實現(xiàn)GQDs的大規(guī)模、高效率穩(wěn)定生產(chǎn)。目前，盡管基于GQDs在生物醫(yī)藥應(yīng)用的進(jìn)展令人興奮和鼓舞人心，但仍然面臨著許多挑戰(zhàn)。特別是在免疫傳感器方面，基于GQDs的免疫傳感仍處于起步階段。需要更多腫瘤標(biāo)志物、疾病診斷相關(guān)的免疫傳感器應(yīng)用的研究，更多基于GQDs的超敏免疫傳感器的構(gòu)建為疾病診斷和治療提供支撐。GQDs具有不同顏色的光致發(fā)光(PL)特性，雖然對這一特性已經(jīng)提出了一些可能的機制，如尺寸效應(yīng)、表面修飾和其他元素?fù)诫s，但關(guān)于GQDs的光致發(fā)光特性了解仍然很貧乏，限制了其在免疫傳感方面的應(yīng)用空間，慶幸的是研究人員正開發(fā)一系列新的表面修飾策略，GQDs無疑將被用于更多更有創(chuàng)意的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域。

總之，GQDs作為一種新型的納米復(fù)合材料，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用依賴于包括化學(xué)、物理、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)在內(nèi)的多個學(xué)科之間的有效協(xié)作。本綜述總結(jié)了近年來基于GQDs的納米材料的研究進(jìn)展，重點介紹了其在體外和體內(nèi)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，以及細(xì)胞水平的GQDs的體內(nèi)毒性。然而關(guān)于GQDs在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用仍有許多尚未解決的問題，只有不斷研究GQDs的生物毒性以及排泄機制，才能促進(jìn)基于GQDs的納米材料在生物醫(yī)學(xué)方面得到更廣泛的應(yīng)用。