響應(yīng)面優(yōu)化超臨界CO2萃取玉米須多酚工藝及抗氧化性研究

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化152061）

玉米須是禾本科作物玉米的花柱和柱頭，是一種傳統(tǒng)的中藥材，玉米須中含有豐富的功能性成分如多糖、黃酮、皂甙、多酚等，具有降壓、降血糖、抗癌細(xì)胞增殖、止血、利尿、抗氧化等多種作用[1-3]，然而玉米須通常被作為廢棄物丟掉，不僅污染環(huán)境，而且造成資源浪費(fèi)[4]。超臨界二氧化碳萃取技術(shù)作為一種新型綠色分離提取技術(shù)，憑借其萃取溫度低、萃取能力強(qiáng)、萃取效率高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于功能性物質(zhì)的提取方面[5-7]。試驗(yàn)以玉米須為原料，以玉米須多酚提取量為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化超臨界二氧化碳提取玉米須多酚的工藝條件，并對其進(jìn)行抗氧化性研究，為玉米須多酚提取及作為天然抗氧化劑的進(jìn)一步應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

玉米須：采自綏化市農(nóng)田，清洗、晾干，粉碎過篩；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（含量：99%）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；DPPH（分析純）：美國sigma公司；2，6-二叔丁基對甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）（化學(xué)純）：上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸（VC）（分析純）：無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；福林酚試劑、無水乙醇（分析純）、碳酸鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

Spe-ed SFE超臨界CO2萃取儀：美國ASI公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；XH-C漩渦混合器：江蘇省金壇市指前鎮(zhèn)旭日實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 萃取方法

稱取粉碎后的玉米須10 g，裝入萃取釜中，加夾帶劑乙醇充分浸潤，按單因素及中心組合設(shè)計(jì)，進(jìn)行超臨界CO2靜態(tài)結(jié)合動(dòng)態(tài)萃取多酚，萃取結(jié)束后，收集多酚提取物，定容后進(jìn)行總酚含量的測定。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 萃取壓力對玉米須多酚提取量的影響

萃取溫度45℃，夾帶劑為75%乙醇水溶液，料液比 1∶1.5（g/mL），萃取時(shí)間為靜態(tài)萃取 1.5 h，再動(dòng)態(tài)萃取 0.5 h，考察萃取壓力 30、35、40、45、50 MPa 對玉米須多酚提取量的影響。

1.3.2.2 萃取溫度對玉米須多酚提取量的影響

萃取壓力35 MPa，夾帶劑為75%乙醇水溶液，料液比1∶1.5（g/mL），萃取時(shí)間為靜態(tài)萃取 1.5 h，再動(dòng)態(tài)萃取 0.5 h，考察萃取溫度 35、40、45、50、55 ℃對玉米須多酚提取量的影響。

1.3.2.3 萃取時(shí)間對玉米須多酚提取量的影響

萃取壓力35 MPa，夾帶劑為75%乙醇水溶液，料液比 1∶1.5（g/mL），萃取溫度 50℃，靜態(tài)萃取一定時(shí)間后，再動(dòng)態(tài)萃取0.5 h，考察靜態(tài)萃取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h對玉米須多酚提取量的影響。

1.3.2.4 夾帶劑乙醇濃度對玉米須多酚提取量的影響

萃取壓力 35 MPa，料液比 1 ∶1.5（g/mL），萃取溫度50℃，靜態(tài)萃取時(shí)間1.5 h，考察夾帶劑乙醇濃度45%、55%、65%、75%和85%對玉米須多酚提取量的影響。

1.3.3 中心組合試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對多酚提取影響顯著的3個(gè)因素即萃取壓力（X1）、萃取溫度（X2）及夾帶劑乙醇濃度（X3）進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)[8]，以多酚提取量為評價(jià)指標(biāo)，確定最佳提取工藝條件，因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平編碼值Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in response surface analysis

1.3.4 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及多酚提取量的測定

采用福林酚比色法測定[9]。將沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用去離子水定容。吸取上述不同濃度沒食子酸溶液各1 mL，依次加入0.30 mL福林酚試劑、1.5 mL飽和Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，搖勻、室溫下靜置20 min，于760 nm處測吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 y＝0.1171x＋0.041 4，相關(guān)系數(shù) R2=0.996 1。將玉米須多酚的超臨界CO2萃取物稀釋至適宜濃度后，吸取1 mL樣液，按照上述方法測定，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算多酚提取量。

1.3.5 玉米須多酚的抗氧化試驗(yàn)

將最優(yōu)條件下萃取得到的多酚配成質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250 μg/mL 的多酚溶液進(jìn)行 DPPH 自由基清除效果的測定，以相同濃度的VC和BHT作對照，測定方法參考Shimada等的方法進(jìn)行[10]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為x±s，采用Sigmaplot 11.0軟件作圖及Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 萃取壓力對玉米須多酚提取量的影響

萃取壓力對玉米須多酚提取量的影響結(jié)果見圖1。

圖1 萃取壓力對玉米須多酚提取量的影響Fig.1 Effect of extraction pressure on extraction amount of corn silk polyphenol

從圖1看出，隨著萃取壓力的增加，多酚提取量逐漸增加，當(dāng)壓力達(dá)到35 MPa時(shí)，提取量達(dá)到最大為8.43 mg/g，再隨著壓力的增加，提取量反而下降，這可能是因?yàn)檩^高的壓力使CO2密度增加，進(jìn)而更多的溶質(zhì)溶于其中，利于多酚的萃取[11]，然而當(dāng)萃取壓力過高時(shí)，不僅傳質(zhì)阻力增大，而且夾帶劑乙醇分子在高壓下可能發(fā)生凝聚而導(dǎo)致溶質(zhì)的溶解性降低[12]，進(jìn)而使多酚提取量下降。

2.1.2 萃取溫度對玉米須多酚提取量的影響

萃取溫度對玉米須多酚提取量的影響結(jié)果見圖2。

圖2 萃取溫度對玉米須多酚提取量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction amount of corn silk polyphenol

從圖2看出，隨著萃取溫度的增加，溶質(zhì)的擴(kuò)散能力增加，利于多酚的提取，當(dāng)溫度為50℃時(shí)，提取量最高，隨著溫度的繼續(xù)升高，CO2密度降低，溶質(zhì)的溶解度降低[13]，進(jìn)而多酚的提取量降低，因此多酚萃取的最佳溫度為50℃。

2.1.3 萃取時(shí)間對玉米須多酚提取量的影響

萃取時(shí)間對玉米須多酚提取量的影響結(jié)果見圖3。

圖3 萃取時(shí)間對玉米須多酚提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction amount of corn silk polyphenol

從圖3看出，隨著萃取時(shí)間的延長，玉米須多酚提取量逐漸升高，萃取時(shí)間達(dá)1.5 h，萃取過程基本平衡，隨著時(shí)間的增加，提取量反而略有下降，可能是在密閉環(huán)境下，溫度和壓力的協(xié)同作用對多酚物質(zhì)造成了破壞[14]，因此，選定最適宜的時(shí)間為1.5 h。

2.1.4 夾帶劑乙醇濃度對玉米須多酚提取量的影響

乙醇濃度對玉米須多酚提取量的影響結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇濃度對玉米須多酚提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction amount of corn silk polyphenol

玉米須多酚分子極性較大，難溶于CO2中，借助夾帶劑乙醇水溶液可以提高超臨界流體對多酚的溶解性[15]。從圖4看出，隨著乙醇濃度的增加，玉米須多酚的提取量增加，當(dāng)乙醇濃度為75%時(shí)，萃取效果最好，隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加，多酚提取量反而下降，可能是因?yàn)檩^高的乙醇濃度由于其含水量的減少，細(xì)胞通透性變差，多酚不易向外擴(kuò)散，進(jìn)而使提取量降低，因此夾帶劑乙醇濃度以75%為最佳。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以玉米須多酚提取量為考察值，進(jìn)行三因素三水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（3個(gè)中心點(diǎn)）的響應(yīng)面分析試驗(yàn)[16]，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

通過Design-Expert 7.0軟件對響應(yīng)值與各因素進(jìn)行多元回歸擬合，得到以玉米須多酚提取量為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：

回歸模型方差分析見表3。

從表3看出，萃取壓力和萃取溫度對玉米須多酚提取量的影響極顯著（P＜0.01），萃取壓力的影響大于萃取溫度，而且二者的交互作用也達(dá)到顯著水平（P＜0.05），說明萃取壓力和萃取溫度的相互作用對玉米須多酚提取量有顯著影響。回歸模型P=0.003 4＜0.01，達(dá)到極顯著水平，說明該方程能準(zhǔn)確反映多酚提取量與各因素之間的關(guān)系，失擬項(xiàng)P=0.632 4＞0.05，不顯著，說明方程對試驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)誤差小，相關(guān)系數(shù)R2=0.960 8，說明有96.08%的數(shù)據(jù)可以用此回歸模型來解釋。最終由回歸方程得到的最高指標(biāo)時(shí)各個(gè)因素的組合：Y=8.685 06，X1=36.81，X2=54.73，X3=75.65，即萃取壓力36.81 MPa，萃取溫度54.73℃，夾帶劑乙醇濃度75.65%，在此條件下，玉米須多酚的提取量為8.685 06 mg/g。

表3 回歸模型方差分析Table 3 The results of variance analysis using the regression

圖5 萃取壓力、萃取溫度的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot for interactive effect of extraction pressure and extraction temperature on extraction amount of polyphenol

根據(jù)回歸分析結(jié)果做響應(yīng)面圖及其等高線圖見圖5到圖7。

圖6 萃取壓力、乙醇濃度的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot for interactive effect of extraction pressure and ethanol concentration on extraction amount of polyphenol

圖7 萃取溫度、乙醇濃度的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot for interactive effect of extraction temperature and ethanol concentration on extraction amount of polyphenol

擬合的響應(yīng)面和等高線圖能比較直觀地反映各因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響。從圖中看出，萃取壓力和萃取溫度交互作用顯著，萃取壓力和乙醇濃度交互作用最小。通過對響應(yīng)面圖的陡峭程度分析可知，萃取壓力對多酚提取量影響最大，乙醇濃度的影響相對最小，這一結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

為檢驗(yàn)預(yù)測結(jié)果的可靠性，采取最優(yōu)條件對玉米須多酚進(jìn)行提取，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為萃取壓力37 MPa，萃取溫度55℃，夾帶劑乙醇濃度為76%，3次平行試驗(yàn)得到實(shí)際的提取量為8.54 mg/g，與最優(yōu)理論值相近，說明響應(yīng)面優(yōu)化的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有可行性。

2.3 玉米須多酚對DPPH自由基的清除效果

不同濃度的玉米須多酚、VC和BHT對DPPH自由基清除率的影響見圖8。

從圖8中看出，隨著玉米須多酚、VC和BHT各自濃度的增加，DPPH自由基的清除效率逐漸增加，雖然在較低濃度（50 μg/mL 和 100 μg/mL）時(shí)，玉米須多酚的清除效果劣于BHT和VC（P＜0.05），但當(dāng)濃度達(dá)到250 μg/mL 時(shí)，三者抗氧化效果相當(dāng)（P ＞0.05），說明玉米須多酚具有一定的抗氧化能力。

圖8 玉米須多酚與VC和BHT對DPPH自由基的清除能力Fig.8 The scavenging activity of corn silk polyphenol，VCand BHT on DPPH·

3 結(jié)論

超臨界CO2萃取玉米須多酚的最佳工藝為萃取壓力37 MPa，萃取溫度55℃，夾帶劑乙醇濃度76%，靜態(tài)萃取時(shí)間1.5 h，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間0.5 h，在此條件下，玉米須多酚提取量為8.54 mg/g。超臨界流體萃取工藝簡單、綠色高效，得到的玉米須多酚能夠作為一種天然抗氧化劑應(yīng)用于食品中，具有一定的發(fā)展前景。