響應(yīng)面法優(yōu)化雙孢菇鮮味物質(zhì)提取工藝的研究

盧朝婷，劉江，王曉君，沈秋霞，劉洪,*，李明元，吉禮

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都610039；2.四川省食品生產(chǎn)安全協(xié)會(huì)，四川成都610061）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又稱白蘑菇、洋蘑菇，是天然的綠色食品原料，具有藥用價(jià)值高和營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，為當(dāng)今最廣泛、產(chǎn)量最大、消費(fèi)量最高的食用菌之一。近幾年來(lái)，我國(guó)蘑菇栽培發(fā)展迅速，產(chǎn)量和出口量超越美國(guó)躍居世界第一，是我國(guó)近年來(lái)出口量最大的食用菌之一[1]。其氨基酸組成全面，并含有人體所需的8種必需氨基酸[2]，尤其是含有豐盛的呈鮮核苷酸（如：肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸、胞苷酸等）和呈味氨基酸（如：谷氨酸、天冬氨酸等），不僅富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且還有特殊的菇味，具有“素中之王”的稱號(hào)。雙孢菇營(yíng)養(yǎng)豐富，肉質(zhì)肥厚，味道鮮美，且熱能低，是高蛋白質(zhì)、低脂肪食品[3]。我國(guó)是雙孢菇生產(chǎn)大國(guó)，雙孢菇含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，具有醫(yī)療保健作用，氣味獨(dú)特味道鮮美，深得消費(fèi)者喜愛(ài)，國(guó)內(nèi)消費(fèi)逐年增加。但由于采摘后雙孢蘑菇中的多酚物質(zhì)易發(fā)生褐變，使雙孢蘑菇風(fēng)味變壞，失去商業(yè)價(jià)值，阻礙了雙孢蘑菇深加工的發(fā)展[4]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)雙孢蘑菇的探討研究只在雙孢菇的采后生理、貯藏保鮮及活性物質(zhì)提取等方面，市面上雙孢蘑菇加工大多是干制、罐藏、鹽制等技術(shù)，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊且較單一，產(chǎn)業(yè)鏈短，深加工產(chǎn)品不足，因此，市場(chǎng)急需開(kāi)發(fā)新型的雙孢蘑菇深加工產(chǎn)品類(lèi)型來(lái)滿足需求，提高雙孢菇利用率和質(zhì)量，促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]。

氨基酸是非常重要的呈味呈鮮物質(zhì)，其中，呈鮮氨基酸在金針菇等食用菌中的含量超過(guò)氨基酸總量的40%，而谷氨酸則是重要的呈味氨基酸，其與食鹽共用鮮味明顯[6]。雙孢菇中含有非常豐富的呈味氨基酸，其中的谷氨酸、天冬氨酸、胞苷酸以及鳥(niǎo)苷酸等核苷酸均具有較強(qiáng)的呈鮮效果[7]。通過(guò)將這些具有鮮味的成分作為鮮味劑應(yīng)用于調(diào)味品中，對(duì)于延長(zhǎng)雙孢菇產(chǎn)業(yè)鏈，豐富雙孢菇市場(chǎng)具有積極作用[8]。本研究以雙孢菇為原料，利用纖維素酶來(lái)提取雙孢菇中的鮮味物質(zhì)，并結(jié)合響應(yīng)面法，應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理，以α-氨基氮含量為主要考核指標(biāo)，對(duì)雙孢菇中鮮味物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為更好的開(kāi)發(fā)雙孢菇產(chǎn)品提供參考，豐富食用菌市場(chǎng)，為雙孢蘑菇的深加工和綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇子實(shí)體：市售，選取外形完整、無(wú)褐變、已干燥的雙孢菇備用；纖維素酶（5萬(wàn)U/g）：和氏璧生物有限公司；β-環(huán)糊精：郁南縣永光環(huán)狀糊精有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）：北京奧博生物技藝有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FB124型電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；XT-100L型多功能粉碎機(jī)：水康市紅太陽(yáng)電機(jī)有限公司；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-320型多功能酸度計(jì)：成都世紀(jì)方舟科技有限公司；WFJ2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：江蘇金壇市金城國(guó)勝試驗(yàn)儀器廠；RE-52AA抽真空蒸發(fā)器、電熱式XFH不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海亞榮生化儀器廠；EYELA超微噴霧干燥儀：瑞士BUCHI公司；SH420型石墨消解儀、K1100型全自動(dòng)凱氏定氮儀器：山東海能科學(xué)儀器有限公司；HXGZXA4恒溫干燥箱：浙江光合力通世紀(jì)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 制備工藝

雙孢蘑菇→除雜→粉碎→酶解→過(guò)濾→濃縮→噴霧干燥→雙孢蘑菇粉狀鮮味料

1.3.2 雙孢菇的預(yù)處理

將購(gòu)買(mǎi)的外形完整、無(wú)褐變、已干燥的雙孢菇，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩，菇粉備用。

1.3.3 雙孢菇的水解

取一定量粉碎后的雙孢蘑菇，加入一定水浸泡，混合均勻，加入一定量的纖維素酶，調(diào)節(jié)pH值，放入恒溫水浴鍋中振蕩酶解一段時(shí)間。酶解結(jié)束后，在沸水浴中滅酶10 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清液，即得雙孢菇水解液[9-10]。

1.3.4 α-氨基氮含量的測(cè)定——茚三酮比色法[11]

在堿性溶液中氨基酸（除脯氨酸外）能與茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物，用吸光光度法可測(cè)定。藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與甘氨基酸含量成正比，最大吸收波長(zhǎng)為570 nm，故以此能夠測(cè)定樣品中氨基酸的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取1 μg/mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于 7 個(gè) 25 mL 容量瓶中，各加水補(bǔ)充至容積為1.2 mL，然后加pH5.4乙酸-乙酸鈉緩沖液和茚三酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%）各1.0 mL，加抗壞血酸溶液0.1 mL，混合均勻，在沸水浴中加熱15 min，取出用冷水快速冷卻至室溫，定容，搖勻，靜置15 min，在570 nm波長(zhǎng)下，以空白試劑為參比測(cè)定各溶液吸光度A，以氨基酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

式中：m為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得氨基氮質(zhì)量，μg；m1為測(cè)定樣品的質(zhì)量，g。

1.3.5 蛋白質(zhì)的測(cè)定

蛋白質(zhì)的測(cè)定參照GB 5009.5《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[12]第一法凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 單因素試驗(yàn)及設(shè)計(jì)方案

對(duì)加酶量、酶解pH值、酶解溫度和酶解時(shí)間4個(gè)單因素分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)因素取6個(gè)梯度，每個(gè)梯度各做3個(gè)平行處理，并對(duì)其α-氨基氮含量及蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果取平均值，各因素變量的梯度水平見(jiàn)表1。

表1 各單因素變量的梯度水平Table 1 Gradient levels of each single factor variable

1.3.7 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間這3個(gè)對(duì)雙孢菇香味物質(zhì)影響較顯著的單因素為自變量，以α-氨基氮含量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究在各單因素共同作用下的最佳工藝參數(shù)，試驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Box-Behnken experimental design factors and levels

1.3.8 雙孢菇風(fēng)味料產(chǎn)品分析

雙孢蘑菇風(fēng)味料是一種具有豐富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的調(diào)味料，具有菇類(lèi)風(fēng)味、速溶等特點(diǎn)，參照SB/T 10484《菇精調(diào)味料》[13]和 SB/T 10371《雞精調(diào)味料》[14]對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-氨基氮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，A570nm處的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=1.211 5 X+0.006 1，相關(guān)系數(shù)為0.999 1。

圖1 α-氨基氮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of α-amino nitrogen

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同加酶量對(duì)鮮味物質(zhì)提取的影響

加酶量對(duì)鮮味物質(zhì)提取的影響見(jiàn)圖2。

圖2 加酶量對(duì)鮮味物質(zhì)提取的影響Fig.2 The effect of enzyme addition on flavor extraction

由圖2可知：隨著纖維素酶添加量的增加，α-氨基氮含量先急速增加再趨于平緩，在1 000 U/g后趨于平穩(wěn)，繼續(xù)添加酶量對(duì)α-氨基氮含量影響不大。蛋白質(zhì)含量逐漸增加，并隨著加酶量加大后，蛋白質(zhì)含量上升緩慢。這可能是加酶量在低水平時(shí)，酶濃度偏低，因此酶可以與底物充分結(jié)合，所以α-氨基氮和蛋白質(zhì)均上升，隨著加酶量的不斷增加，底物已經(jīng)與酶結(jié)合，多余的酶無(wú)法與底物充分結(jié)合，因此導(dǎo)致酶的作用受到抑制[15]。當(dāng)加酶量在1 000 U/g后α-氨基氮含量趨于平穩(wěn)，繼續(xù)添加酶量對(duì)α-氨基氮含量影響不大。因此從節(jié)約成本和實(shí)際考慮，選擇較佳酶量為1 000 U/g。

2.2.2 不同溫度下纖維素酶的酶解效果的影響

溫度對(duì)鮮味物質(zhì)提取的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)鮮味物質(zhì)提取的影響Fig.3 Effect of digesting temperature on flavor extraction

由圖3可知：隨著酶解溫度的增加，α-氨基氮含量和蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)先逐漸上升再下降的趨勢(shì)，α-氨基氮含量在55℃達(dá)到最大。這可能是因?yàn)闇囟葘?duì)酶活性影響較大，在溫度低于酶的最適溫度時(shí)，隨著溫度的上升其酶活性不斷增強(qiáng)，因此其對(duì)細(xì)胞壁的破損能力增強(qiáng)，并在最適溫度時(shí)活力最大，隨著溫度的不斷增加，當(dāng)其超過(guò)最佳酶解溫度時(shí)，隨著溫度的升高，其活力逐漸下降[16]，因此酶解溫度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)抑制酶的活力，導(dǎo)致酶解效果不好，因此纖維素酶的較佳酶解溫度為55℃。

2.2.3 不同酶解pH值對(duì)纖維素酶的酶解影響

pH值對(duì)鮮味物質(zhì)提取的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酶解pH值對(duì)鮮味物質(zhì)提取的影響Fig.4 Effect of enzymolysis pH value on flavor extraction

由圖4可知：隨著pH值的升高，蛋白質(zhì)含量均隨著pH值的增加而增加，α-氨基氮含量隨著pH值的升高，先升高后逐漸下降，pH值繼續(xù)增大，α-氨基氮含量下降趨于平穩(wěn)。這有可能是pH值過(guò)高或過(guò)低影響了酶的構(gòu)象，降低了酶解效率，故選pH5.5為較佳初始pH值。

2.2.4 不同酶解時(shí)間下對(duì)纖維素酶的酶解影響

酶解時(shí)間對(duì)鮮味物質(zhì)提取的影響見(jiàn)圖5。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)鮮味物質(zhì)提取的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on flavor extraction

由圖5可知：隨著酶解時(shí)間的增長(zhǎng)，α-氨基氮含量和蛋白質(zhì)含量在上升，當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)120 min時(shí)，α-氨基氮含量開(kāi)始下降。這可能是隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)混合物中溶解性肽慢慢增加、底物濃度變小，這些反應(yīng)產(chǎn)物與未水解的雙孢蘑菇粉對(duì)酶產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。由于酶解時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)增加試驗(yàn)的成本，故選擇最佳酶解時(shí)間為120 min。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇A加酶量、B酶解時(shí)間、C酶解溫度3個(gè)因素所確定的水平范圍，利用Design-expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)Box-Benhnken的設(shè)計(jì)原理，以α-氨基氮含量為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平共17組試驗(yàn)的響應(yīng)面分析，結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analys

2.4 纖維素酶響應(yīng)面方差分析

2.4.1 以α-氨基氮含量為響應(yīng)值的方差分析

纖維素酶響應(yīng)面方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，對(duì)α-氨基氮含量所建立的二次多項(xiàng)回歸模型具有高度的顯著性（P=0.000 4＜0.01），失項(xiàng)P=0.508 0＞0.05，表示水平不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)有極小的概率受到受到未知因素干擾，即模型符合要求；模型的調(diào)整確定系數(shù)R2=0.961 1說(shuō)明回歸方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好，回歸效果好，可以用此模型對(duì)α-氨基氮含量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。通過(guò)比較各項(xiàng)F值，研究各因子對(duì)纖維素酶酶解雙孢蘑菇的影響，確定各因子影響到主次關(guān)系，即B（酶解時(shí)間）＞C（酶解溫度）＞A（加酶量）。

2.4.2 以α-氨基氮含量為響應(yīng)值的擬合模型

以α-氨基氮含量為響應(yīng)值，對(duì)纖維素酶酶解雙孢蘑菇試驗(yàn)進(jìn)行二次多元回歸擬合，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到回歸方程：

表4 纖維素酶響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 4 The cellulose variance analysis of RSM

2.4.3 以α-氨基氮含量為響應(yīng)值的響應(yīng)面圖分析

響應(yīng)面模型是A、B、C各試驗(yàn)因子所構(gòu)成的三維空間曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上能夠看出纖維素酶加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度任意一變量取零水平時(shí)，其余兩個(gè)變量對(duì)雙孢蘑菇α-氨基氮含量的影響見(jiàn)圖6。

從圖6可以看出，α-氨基氮含量隨各兩因素的增加均是呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢(shì)。等高線的形狀為橢圓形，則表示兩因素的交互作用強(qiáng)；等高線的形狀為圓形時(shí)，則表示兩因素的交互作用弱[17]。從圖6可以看出，不論是加酶量和酶解時(shí)間、加酶量和酶解溫度以及酶解時(shí)間和酶解溫度之間交互作用的等高線均為橢圓形，這就說(shuō)明各兩因素之間的交互作用顯著。從其三維空間曲面圖可以看出，加酶量、酶解時(shí)間和酶解溫度兩兩交互時(shí)，對(duì)α-氨基氮含量的影響均呈現(xiàn)拋物線形狀，即隨著加酶量、酶解時(shí)間和酶解溫度的升高，α-氨基氮含量先增加后降低，因此，在酶解時(shí)，適當(dāng)?shù)脑黾蛹用噶?、酶解溫度，延長(zhǎng)酶解時(shí)間可以提高α-氨基氮的含量。

2.5 優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果及分析

圖6 不同因素對(duì)雙孢菇α-氨基氮含量影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.6 Response surface and contour of different factors affecting α-amino nitrogen content of Agaricus bisporus

為精確的計(jì)算纖維素酶的最佳酶解條件，利用回歸方程對(duì)各自變量（A、B、C）求極值，得到極值點(diǎn)為0.63、0.41、C=0.05，即纖維素酶加酶量 1 257.04 U/g、酶解時(shí)間110.09 min、酶解溫度50.2℃，此條件下α-氨基氮含量為28.085 5 mg/g，得到纖維素酶酶解雙孢蘑菇的最優(yōu)工藝參數(shù)。結(jié)合實(shí)際，調(diào)整各因素為：加酶量1 000 U/g、酶解時(shí)間110 min、酶解溫度50℃。此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果如表5所示，α-氨基氮含量為27.94 mg/g，與預(yù)測(cè)值相差為0.5%，證明了該模型的可靠性。

表5 纖維素酶最佳工藝試驗(yàn)表Table 5 The best process test of cellulose

2.6 指標(biāo)測(cè)定

2.6.1 感官指標(biāo)

色澤：淺灰黃色。

香氣：有食用菌特殊的芳香氣味，無(wú)不良?xì)馕逗彤愇丁?/p>

滋味：鮮美滋味，口感柔和，口味適中，無(wú)刺激性。

形態(tài)：粉狀，無(wú)霉變和結(jié)塊。

2.6.2 理化指標(biāo)

雙孢蘑菇粉狀調(diào)味料的理化指標(biāo)如表6所示。

表6 理化指標(biāo)Table 6 The index of physics and chemistry

2.6.3 衛(wèi)生指標(biāo)

雙孢蘑菇粉狀調(diào)味料的衛(wèi)生指標(biāo)如表7所示。

表7 衛(wèi)生指標(biāo)Table 7 The index of microbiological

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)單因素試驗(yàn)可以得出，當(dāng)其他條件相同的情況時(shí)，每個(gè)單因素對(duì)雙孢菇香味物質(zhì)提取的影響情況以及最佳值，結(jié)果顯示，在單因素試驗(yàn)中，選擇最佳加酶量為1 000 U/g、最佳酶解pH值為5.5、酶解最佳溫度為50℃、最佳酶解時(shí)間為120 min。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)雙孢菇酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終得到最佳組合工藝條件為纖維素酶加酶量1 257.04 U/g、酶解時(shí)間110.09 min、酶解溫度50.2℃，結(jié)合實(shí)際，調(diào)整各因素為：加酶量1 000 U/g、酶解時(shí)間110 min、酶解溫度50℃，此條件下α-氨基氮含量為27.94 mg/g，與預(yù)測(cè)值基本相符。