鼓室內(nèi)接種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌構(gòu)建大鼠鼓室硬化模型

黃玉 劉磊 劉愛國

鼓室硬化是指鼓膜固有層、中耳粘膜下層結(jié)締組織甚或乳突發(fā)生透明樣變性、鈣質(zhì)沉著或骨化改變，它的形成通常經(jīng)歷炎性滲出、透明樣變和鈣化形成三個階段。盡管關于鼓室硬化臨床和形態(tài)學方面的研究有很多，但其發(fā)病機制仍不清楚，通常認為其發(fā)病與細菌感染、氧自由基損傷、高鈣、一氧化氮、解剖、遺傳、免疫、分泌性中耳炎長期置管、骨形態(tài)生成蛋白等因素有關[1～7]，臨床上多采用手術(shù)治療。

為了探討鼓室硬化的發(fā)病機制，很多研究構(gòu)建了鼓室硬化的動物模型。大多數(shù)研究者通常采用細菌鼓室內(nèi)注射的方法來構(gòu)建動物模型，而所選用的細菌通常是肺炎鏈球菌。由于抗生素的濫用，細菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象在全球已經(jīng)變的越來越廣泛[8,9]，在引起抗生素抵抗的這些菌種中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)比較受關注。在皮膚感染、軟組織感染、血行感染、醫(yī)院獲得性感染等眾多感染的治療過程中，MRSA都是一個比較棘手的問題。在耳相關疾病中，MRSA感染率已經(jīng)從0.3%上升到了24.8%[10～13]，因此，本研究選用鼓室內(nèi)接種MRSA來構(gòu)建大鼠鼓室硬化模型，旨在探討該方法的可行性，為鼓室硬化的研究提供一種新的動物造模方法。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 由湖北省實驗動物中心提供SPF(specific pathogen free)級雄性SD大鼠34只，體重200 g，經(jīng)耳科顯微鏡觀察證實外耳道和鼓膜均正常。將34只大鼠隨機分為實驗組17只和對照組17只。實驗組左耳進行鼓室硬化造模，實驗組右耳和對照組雙耳不予處理。

1.2MRSA懸液制備 由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院檢驗科實驗室提供MRSA菌株。將菌株挑至羊血瓊脂平板置于CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水將菌落調(diào)制成濃度為1×108/L的懸液備用。

1.3鼓室硬化動物造模 于實驗組SD大鼠腹腔內(nèi)注射10%的水合氯醛(3.5 ml/kg)進行全身麻醉，將左耳固定朝上，耳科顯微鏡下充分暴露外耳道和鼓膜。用1 ml注射器抽取0.04 ml濃度為1×108/L的MRSA懸液，于左耳鼓膜前上象限進行鼓室內(nèi)注射。所有大鼠均未給予任何局部或全身抗感染治療。

1.4耳顯微鏡下觀察方法和分級標準 分別于造模后第1、2、4、6周，在耳微鏡下觀察并記錄所有存活大鼠雙耳鼓膜充血、鼓室積膿和鼓室硬化的程度。鼓膜充血分為4個程度：“-”無鼓膜充血；“+”錘骨柄附近有充血；“++”除了錘骨柄附近充血外，錘骨韌帶也有充血；“+++”充血蔓延至整個鼓膜。鼓室積膿分為4個程度：“-”無鼓室積膿；“+”鼓室積膿的體積不超過鼓室腔總體積的25%；“++”鼓室積膿的體積介于25%到50%之間；“+++”鼓室積膿的體積超過鼓室腔總體積的50%[14]。鼓室硬化分為4級：0級，無鼓室鈣化灶；1級，鼓膜臍部出現(xiàn)局部鈣化灶；2級，除了鼓膜臍部出現(xiàn)鈣化灶外，錘骨柄和鼓環(huán)也出現(xiàn)鈣化灶；3級，鈣化灶遍布整個鼓膜[15,16]。

1.5石蠟切片與HE染色 取正常大鼠的左耳聽泡及鼓室硬化大鼠的左、右耳聽泡，分別經(jīng)過固定劑固定、乙醇脫水、二甲苯透明，經(jīng)過透明的聽泡在恒溫箱中用石蠟和二甲苯進行透蠟(處理3次，每次15分鐘)，然后用蠟進行包埋，于包埋聽泡的長軸進行多個切片，并做好標注。將做好的石蠟切片依次放入二甲苯和梯度酒精中進行脫蠟，用蒸餾水沖洗后進行蘇木素染核、鹽酸酒精分化及氨水返藍，流水沖洗后用伊紅染細胞質(zhì)，蒸餾水洗后放入梯度酒精和二甲苯中脫水透明，晾干后用中性樹膠封片，最后進行顯微鏡觀察及圖像采集。

2 結(jié)果

造模后第1周末，實驗組17只大鼠(分別編為1～17號)34耳中有16耳(47.06%，左側(cè)15耳，右側(cè)1耳)成功誘發(fā)急性化膿性中耳炎，主要表現(xiàn)為鼓膜穿孔、鼓膜充血和鼓室積膿，無鼓室硬化形成耳(表1)；第2周末，實驗組共有16只大鼠存活，2號大鼠因肺部感染死亡，將余下16只大鼠重新編為1～16號，32耳中有16耳(50.0%，左側(cè)13耳，右側(cè)3耳)發(fā)生化膿性中耳炎，左側(cè)中4耳發(fā)生鼓室硬化(12.5%)，每只大鼠雙耳內(nèi)鼓膜充血、鼓室積膿和鼓室硬化程度見表2。第4周末，實驗組共有13只大鼠存活，1號和7號大鼠皆因肺部感染死亡，16號大鼠因麻醉過量死亡，將13只大鼠重新編為1～13號；26耳中有15耳(57.7%，左側(cè)11耳，右側(cè)4耳)發(fā)生化膿性中耳炎，有10耳(38.5%)發(fā)生鼓室硬化，左耳7耳，右耳3耳；每只大鼠雙耳內(nèi)鼓膜充血、鼓室積膿和鼓室硬化程度見表3。第6周末，實驗組共有11只大鼠存活，1號和13號大鼠因肺部感染死亡，將11只大鼠重新編為1～11號；22耳中有1耳(4.5%)存在化膿性中耳炎，有12耳(54.5%)發(fā)生鼓室硬化，左耳7耳，右耳5耳；每只大鼠鼓膜充血、鼓室積膿和鼓室硬化程度見表4。

表1 實驗組造模后1周耳顯微鏡觀察所見

表2 實驗組造模后2周耳顯微鏡觀察所見

表3 實驗組造模后4周耳顯微鏡觀察所見

表4 實驗組造模后6周耳顯微鏡觀察所見

對照組的17只大鼠中，有2只于第4周末因麻醉過量死亡，余15只大鼠全部存活至造模后第6周，所有對照組大鼠雙耳在整個造模觀察期間均未發(fā)生任何異常改變。

兩組耳顯微鏡下及石蠟切片HE染色觀察結(jié)果見圖1～2。

3 討論

細菌感染是急、慢性化膿性中耳炎最常見的病因，而Wielinga等[17]于1993年指出，中耳反復的急、慢性炎癥刺激及長期的化膿性或漿液性滲出是導致鼓室硬化最重要的病因；另有研究[5]也通過觀察發(fā)現(xiàn)，慢性化膿性中耳炎有20%～43%有發(fā)展成鼓室硬化的傾向。因此，本研究模擬人類鼓室硬化的這一主要病因，給予實驗組大鼠鼓室內(nèi)注射MRSA，誘導其發(fā)生化膿性中耳炎，從而構(gòu)建鼓室硬化模型。從文中結(jié)果看，光學顯微鏡觀察實驗組HE染色下的中耳組織，可見鼓膜和鼓室粘膜增厚、炎性細胞浸潤、膠原纖維增生、細胞間質(zhì)增多、新血管形成等改變，這些改變與鼓室硬化的形態(tài)學改變[17,18]一致。

文中結(jié)果顯示實驗組大鼠造模后1周，絕大多數(shù)大鼠左耳均出現(xiàn)不同程度的鼓膜充血和鼓室積膿等急性化膿性中耳炎的表現(xiàn)，造模后2周，已有部分大鼠發(fā)生鼓室硬化；隨著病程的延長，鼓膜充血消退、鼓室膿液吸收，急性中耳炎的癥狀逐漸消失，至6周末11只大鼠22耳中已有12耳發(fā)展成鼓室硬化，余下未發(fā)生鼓室硬化耳趨于愈合，說明本研究所用方法可成功構(gòu)建大鼠鼓室硬化模型。另外，本實驗中，實驗組大鼠鼓室硬化不僅發(fā)生于注射細菌耳，也可發(fā)生于對側(cè)未注射細菌耳，且兩側(cè)耳發(fā)展成鼓室硬化的過程同步。分析其原因，可能是金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生外毒素，外毒素由MRSA產(chǎn)生后，通過血液循環(huán)感染對側(cè)耳，使對側(cè)耳亦發(fā)生急性化膿性中耳炎，再通過炎癥刺激組織修復，炎癥消退，鈣質(zhì)沉著，發(fā)生鼓室硬化。

綜上所述，鼓室內(nèi)接種MRSA構(gòu)建鼓室硬化動物模型的方法切實可行，且與鼓室硬化的臨床發(fā)病過程極為接近，本研究為探索鼓室硬化的發(fā)病機制提供了一種新的鼓室硬化動物造模方法。

圖1 實驗組和對照組耳科顯微鏡下觀察到的化膿性中耳炎和鼓室硬化不同程度的改變 a.正常鼓膜(左);b.+鼓室積膿(左);c.++鼓室積膿(左);d.++鼓室積膿(右);e.+++鼓室積膿(左);f.+++鼓室積膿(右);g.+++鼓室積膿,伴1級鼓室硬化(右);h.++鼓室積膿,伴2級鼓室硬化(左);i.3級鼓室硬化(左);j.3級鼓室硬化(右)

圖2 實驗組和對照組鼓膜和鼓室粘膜的形態(tài)學改變(HE染色×200) a.正常鼓膜(左),可見層次清晰,結(jié)構(gòu)完整;b.正常鼓室粘膜(左),可見層次清晰,結(jié)構(gòu)完整;c.鈣化鼓膜(左),可見鼓膜增厚,炎性細胞浸潤,膠原纖維增生;d.鈣化鼓室粘膜(左),可見粘膜增厚,炎性細胞浸潤,膠原纖維增生,細胞間質(zhì)增多,新生血管形成(箭頭所指);e.鈣化鼓膜(右),可見鼓膜增厚,炎性細胞浸潤,膠原纖維增生;f.鈣化鼓室粘膜(右),可見粘膜增厚,炎性細胞浸潤,膠原纖維增生,細胞間質(zhì)增多