百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽對單側輸尿管梗阻模型大鼠腎臟纖維化的影響*

朱戈麗 喻業(yè)安 陳晚先 張艷霞 封寶紅 伍 軍

百令膠囊、還原型谷胱甘肽臨床應用，能減輕慢性腎臟病癥狀、緩解病情[1,2]，但該兩種藥物聯(lián)合應用治療慢性腎臟病的研究報道少見。本文通過制作單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型，采用HE、SPA及免疫組化染色方法，觀察百令膠囊與還原型谷胱甘肽聯(lián)合治療對UUO大鼠腎臟纖維化的影響及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組治療

清潔級SD大鼠28只，雄性，體重250—300g。隨機分為假手術組(n=7)，實驗大鼠只游離左側輸尿管但不結扎。UUO模型組(UUO組，n=7)，完全結扎左側輸尿管成模。百令膠囊治療組(n=7)，本組大鼠于制模前1天至術后第9天，每日給予百令膠囊聯(lián)合1.5 g/kg灌胃治療一次，制作方法同UUO組。百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱肽組(聯(lián)合治療組，n=7)，本組大鼠于制模前1天至術后第9天，每日給予百令膠囊1.5 g/kg及還原型谷胱甘肽300 mg/kg灌胃治療一次，制模方法同UUO組。百令膠囊購于杭州中美華東制藥有限公司(國藥準字Z10910036)。

1.2 UUO模型制作方法

大鼠禁食水12h后， 3%戊巴比妥鈉溶液按0.5ml/100g腹腔注射麻醉；仰臥固定，去毛，消毒，于左側腹部稍偏下切開約2cm左右切口，逐層分離腹部組織直至腹腔，以左側髂血管為標志，尋找到跨過左側髂血管的左側輸尿管，向上游離輸尿管直至左側腎盂。假手術組大鼠只游離輸尿管不結扎，余三組大鼠均游離輸尿管后使用0號絲線于左側輸尿管腎盂結合處以及向下1cm左右分別完全結扎，復位腸管，逐層縫合關閉腹腔。

1.3 檢測指標和方法

治療9天后，取術側腎組織，于腎臟正中沿垂直腎臟長軸切取數(shù)塊約1—2mm厚腎組織，10%福爾馬林溶液固定后，常規(guī)取材，檢測以下內(nèi)容。所用主要試劑：一抗分別為TGF-β1抗體、Lollagen抗體，均購自武漢博士德生物有限公司； BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天公司；HFP標記羊抗兔二抗購自武漢博士德有限公司； ECL底物，購自Thermo公司；顯影定影試劑，購自天津漢中攝影材料廠。

1.3.1腎臟組織病理觀察：取10%福爾馬林固定的腎組織標本常規(guī)石蠟包埋、切片，常規(guī)方法HE和PAS染色，PAS染色糖原呈紅色，細胞核呈藍色，光鏡下觀察各組腎小管間質(zhì)病變。

1.3.2腎臟組織纖維化：取上述石蠟切片，常規(guī)方法Masson染色，染色纖維呈藍色，光鏡下觀察腎臟組織纖維化。

1.3.3免疫組化染色檢測I型膠原蛋白、TGF-β1和a-SMA表達：取上述石蠟切片，常規(guī)方法脫蠟，0.01M枸櫞酸緩沖液進行抗原修復，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。正常山羊血清封閉液室溫封閉30min。分別滴加不同的一抗，4℃濕盒中孵育15h。滴加山羊抗兔/小鼠二抗，37℃孵育20min。最后加入DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間。蘇木素復染。脫水，封片。采用PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照，陽性染色為棕色。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組腎臟組織病理學變化比較

HE和PAS染色顯示：假手術組大鼠腎臟結構正常，腎小管排列整齊、緊密，腎小管基底膜光滑，間質(zhì)內(nèi)無炎癥細胞侵染。UUO組大鼠腎小管部分上皮細胞空泡變性，部分管腔擴張，腎小管基底膜彌漫性增厚，可見間質(zhì)水腫，炎性細胞浸潤。百令膠囊治療組，腎小管結構較為完整，炎性細胞浸潤減少，但仍見部分腎小管管腔擴張。聯(lián)合治療組腎小管結構較完整、排列整齊，未見明顯管腔擴張和炎細胞浸潤。見圖1、圖2。

2.2 各組腎臟組織纖維化比較

Masson染色后組織纖維呈藍色。結果顯示，假手術組大鼠腎臟組織未見明顯纖維化。UUO組，大鼠腎臟組織纖維化嚴重。百令膠囊治療組和聯(lián)合治療組大鼠纖維化明顯減輕，聯(lián)合治療組效果更明顯。見圖3。

2.3 各組免疫組化指標比較

2.3.1I型膠原蛋白：假手術組腎間質(zhì)I型膠原蛋白陽性(棕色)染色較弱，即I型膠原蛋白表達較少。UUO組可見腎間質(zhì)I型膠原蛋白呈棕色強陽性染色，即I型膠原蛋白表達增加。百令膠囊或百令膠囊聯(lián)合谷胱甘肽治療后，大鼠腎間質(zhì)I型膠原蛋白陽性染色減弱， I型膠原蛋白表達減少，聯(lián)合治療組效果較百令膠囊治療組更少。見圖4。

2.3.2TGF-β1表達：假手術組TGF-β1蛋白染色不明顯，UUO組可見TGF-β1蛋白強陽性(棕色)染色。百令膠囊治療組和聯(lián)合治療組， TGF-β1蛋白陽性染色減弱，聯(lián)合治療組陽性染色更少。見圖5。

2.3.3a-SMA表達：假手術組動脈平滑肌細胞中表達a-SMA，腎間質(zhì)未見a-SMA表達。UUO組腎間質(zhì)a-SMA蛋白陽性染色(棕色)明顯，即a-SMA蛋白表達增加。百令膠囊治療組腎間質(zhì)a-SMA蛋白陽性染色減弱， a-SMA蛋白表達減少，聯(lián)合治療組較百令膠囊治療組更少。見圖6。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學變化(HE染色，×200)

圖2 各組大鼠腎臟組織病理學變化(SPA染色，×200)

圖3 各組大鼠腎臟組織纖維化 (Masson染色，×200)

圖4 各組大鼠腎臟組織I型膠原蛋白表達(免疫組化染色，×200)

圖5 各組大鼠腎臟TGF-β1蛋白表達(免疫組化染色，×200)

圖6 各組大鼠腎臟組織a-SMA蛋白表達(免疫組化染色，×200)

3 討 論

腎臟纖維化是所有慢性腎臟病進展至終末期腎病的一種病理損傷過程。腎臟纖維化形成主要涉及以下幾個環(huán)節(jié)：(1)炎性細胞浸潤；(2)腎臟固有細胞損傷、活化，細胞增殖與凋亡，以及細胞表型轉化；(3)促炎癥因子的異常分泌；(4)細胞外基質(zhì)異常積聚；(5)細胞外基質(zhì)產(chǎn)生與降解功能失調(diào)等，造成大量細胞外基質(zhì)在腎臟內(nèi)沉積，導致腎小球硬化、足細胞丟失，腎小管及間質(zhì)毛細血管減少，腎小管萎縮，完整的腎單位逐漸減少直至消失[3]。因此，改善腎臟纖維化是治療慢性腎臟病的重要環(huán)節(jié)。

目前臨床上常用的純中藥制劑百令膠囊(杭州中美華東制藥有限公司，規(guī)格0.5g)，主要成分是D-甘露醇、蟲草酸、載體生物堿、19種氨基酸、多種維生素及微量元素，具有補肺腎、益精氣的作用[4]。注射用還原型谷胱甘肽(重慶藥友制藥有限公司，商品名：阿拓英蘭，規(guī)格：0.9g/支)，活性成分為還原型谷胱甘肽,廣泛分布于人類肝細胞和腎細胞,參與體內(nèi)氧化還原過程,與過氧化物及自由基結合,組成機體的抗氧化系統(tǒng),清除各種氧和自由基[5，6]。兩者聯(lián)合應用于慢性腎臟病患者，可能起到協(xié)同治療的作用，增強兩藥臨床治療效果。本研究顯示，UUO 大鼠發(fā)生明顯腎間質(zhì)纖維化病理改變。通過百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽治療，明顯改善和減輕UUO大鼠的腎小管基底膜增厚和腎臟組織纖維化。

腎間質(zhì)纖維化的膠原成分主要為Ⅰ 、Ⅲ型膠原，是細胞外基質(zhì)的主要組成部分，在慢性腎臟病過程中發(fā)揮重要作用[7，8]。TGF-β1是纖維化過程中的關鍵調(diào)節(jié)因子, 能夠誘導成纖維細胞向成肌纖維細胞轉分化，參與腎間質(zhì)纖維化過程中的各個環(huán)節(jié)[9]。而a-SMA作為肌成纖維細胞的表面標志,正常的腎間質(zhì)成纖維細胞和腎小管上皮細胞并不表達，但病理狀態(tài)下，腎間質(zhì)成纖維細胞和腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉分化，均表達a-SMA[10]。本研究通過對大鼠腎組織進行Masson檢測、免疫組化檢測，結果均表明百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽治療UUO，可以阻止腎小管上皮細胞轉分化，抑制a-SMA表達，減少膠原及細胞外基質(zhì)合成，且效果優(yōu)于百令膠囊治療組。說明百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽，具有明顯抗腎間質(zhì)纖維化作用。

綜上所述，百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽治療，可能抑制I型膠原蛋白和TGF-β1蛋白高表達，減少成纖維細胞轉化，從而改善腎間質(zhì)纖維化。提示臨床兩藥聯(lián)用，以加強改善患者臨床癥狀，提高對慢性腎臟病患者療效。