外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腎癌病理指標(biāo)及患者預(yù)后的關(guān)系

李昊 陳從波 姚啟盛 龔小芳

[摘要] 目的 探究外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）與腎癌病理指標(biāo)及患者預(yù)后的關(guān)系。 方法 將2014年2月～2017年12月湖北省十堰市太和醫(yī)院收治的107例腎癌患者及查體的20例健康志愿者納入研究，采用免疫磁珠富集及免疫熒光化學(xué)染色法進行外周血CTCs計數(shù)，分析CTCs陽性率與腎癌患者年齡、性別、臨床分期、T分期、Fuhrman分級及中性粒細(xì)胞、血鈣、血小板等臨床指標(biāo)的關(guān)系，并探究外周血CTCs與腎癌患者預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果 腎癌患者CTCs檢出率為66.35%，健康志愿者外周血中未發(fā)現(xiàn)CTCs;CTCs陽性率與患者T分期、臨床分期及中性粒細(xì)胞增多相關(guān)（P < 0.05），Logistic回歸分析提示患者T分期為獨立危險因素（OR = 1.816，95%CI：0.814～4.052，P < 0.05）;所有患者均進行隨訪，隨訪時間為60～627 d，CTCs陽性患者的中位生存時間短于CTCs陰性患者（P < 0.05）。 結(jié)論 外周血CTCs陽性檢出率與腎癌患者T分期、臨床分期及中性粒細(xì)胞增多相關(guān)，其中腫瘤T分期是外周血CTCs的獨立危險因素，外周血CTCs可作為判斷腎癌患者預(yù)后的輔助信息。

[關(guān)鍵詞] 外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞;腎癌;病理指標(biāo);預(yù)后

[中圖分類號] R737.11? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（b）-0085-04

[Abstract] Objective To explore the relationship between peripheral blood circulating tumor cells （CTCs） and pathological paramets， and prognosis of renal cancer. Methods One hundred and seven patients with renal cell carcinoma admitted to Taihe Hospital of Shiyan in Hubei Province， from February 2014 to December 2017 and 20 healthy volunteers who performed physical examination were enrolled in the study. The immunomagnetic enrichment and immunofluorescence staining methods were used to count peripheral blood CTCs. The relationship between the positive rate of CTCs and age， gender， clinical stage， T stage， Fuhrman grade， clinical parameters such as neutrophils， serum calcium and platelets were analyzed. The relationship between peripheral blood CTCs and the prognosis of renal cancer was explored. Results The detection rate of CTCs in patients with renal cancer was 66.35%. No CTCs were found in peripheral blood of healthy volunteers. The positive rate of CTCs was related to the T stage， clinical stage and increase of neutrophils （P < 0.05）. Logistic regression analysis showed that T stage was an independent risk factor （OR = 1.816， 95%CI： 0.814-4.052， P < 0.05）. All the patients were followed up for 60-627 d. The median survival time of CTCs positive patients was shorter than that of CTCs negative patients （P < 0.05）. Conclusion The positive rate of CTCs in peripheral blood is related to T stage， clinical stage and increase of neutrophils in patients with renal cancer. The T stage of tumor is an independent risk factor for peripheral blood CTCs. Peripheral blood CTCs can be used as auxiliary information for judging the prognosis of patients with renal cancer.

[Key words] Peripheral blood circulating tumor cells; Renal cancer; Pathological index; Prognosis

腎癌是發(fā)病率僅次于膀胱癌的泌尿系統(tǒng)腫瘤，近年來有逐年上升的趨勢[1]。外科治療是腎癌主要治療方式，但是約1/3患者在就診時就已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，且術(shù)后極易復(fù)發(fā)，晚期腎癌的預(yù)后效果不佳。因此臨床上腎癌的早期診斷、控制及預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是目前腎癌治療的重大課題之一[2-3]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）是腫瘤原發(fā)或病灶播散于血液中的腫瘤細(xì)胞，可定植形成腫瘤轉(zhuǎn)移病灶，研究顯示CTCs數(shù)量與腫瘤的惡性程度、放化療治療反應(yīng)等密切相關(guān)[4]。對外周血CTCs進行分析研究，可明確癌癥轉(zhuǎn)移過程，對輔助診斷、治療效果監(jiān)測及預(yù)后判斷等方面均具有重要應(yīng)用價值[5-6]。目前，乳腺癌、前列腺癌及結(jié)腸癌CTCs檢測均被批準(zhǔn)用于臨床，而腎癌CTCs的臨床應(yīng)用尚待推進[7]。本研究對腎癌患者及健康志愿者外周血CTCs水平進行測定，聯(lián)系腎癌患者各臨床病理指標(biāo)進行分析，探究外周血CTCs與腎癌預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2014年2月～2017年12月湖北省十堰市太和醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的107例腎癌患者納入研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理科確診為腎癌;患者相關(guān)檢查及病理資料完整;患者及家屬對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重感染、重要臟器病變患者;已接受手術(shù)或放化療等治療的患者。納入107例患者作為腎癌組，其中男63例，女44例;年齡34～71歲，平均（55.96±8.49）歲。TMN分期及臨床分級采用美國癌癥聯(lián)合委員會腎癌分期標(biāo)準(zhǔn)[8]，T分期：1期32例，2期30例，3期24例，4期21例;臨床病理分期：Ⅰ期36例，Ⅱ期29例，Ⅲ期22例，Ⅳ期20例;病理分級采用Fuhrman分級標(biāo)準(zhǔn)[9]，病理分級：1級15例，2級44例，3級38例，4級10例。另擇同期于我院體檢中心進行體檢的20名健康志愿者作為對照組，其中男12名，女8名;年齡34～72歲，平均（54.88±7.67）歲。腎癌組及對照組性別組成及年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），具有可比性。所有患者及家屬均簽署同意書，本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 CTCs檢測方法? 采用免疫磁珠富集及免疫熒光化學(xué)染色法，具體操作：①細(xì)胞富集與固定：采集患者肘正中靜脈血，置于ACD抗凝管中，采集的血液樣本在48 h內(nèi)完成CD45磁珠富集，富集所得的細(xì)胞沉淀物，加入40 μL AS1液重懸細(xì)胞，小心吹打，將混勻的細(xì)胞液加至包被的Cytospin玻片中央加樣區(qū)，靜置1～2 h，待玻片干燥后置于-80℃?zhèn)溆?②細(xì)胞化學(xué)染色：在暗室中，向玻片上加入抗CD45、CK18、CK19、CK8抗體及0.2%BSA熒光抗體，靜置90 min后用BSA及TBS清洗3次，于細(xì)胞區(qū)加入7 μL熒光計數(shù)液，加蓋玻片封片，于顯微鏡下計數(shù)。

1.2.2 CTCs鑒定? 細(xì)胞呈圓形、橢圓形或長形;細(xì)胞形態(tài)及邊緣完整，可見完整細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。免疫熒光染色可見CK18+、CD45-、DAPI+、CK染色與細(xì)胞核有50%以上面積重合。光鏡下可見PanCK染色呈藍黑色或褐色。由兩位經(jīng)培訓(xùn)的實驗員分別按照上述標(biāo)準(zhǔn)進行陽性細(xì)胞的判定及計數(shù)，有意見不一致的情況由2人協(xié)商或在第3人協(xié)助下判定。

1.2.3 數(shù)據(jù)收集? 收集患者臨床分期、T分期、Fuhrman分級及中性粒細(xì)胞、血鈣、血小板等血清學(xué)指標(biāo)。其中臨床分期由2名臨床醫(yī)生獨立進行評定并進行核對，不一致者再次評定;T分期、Fuhrman分級等根據(jù)病理醫(yī)師出具的術(shù)后病理診斷報告記錄;血清學(xué)指標(biāo)根據(jù)血清檢驗報告記錄，白細(xì)胞計數(shù)>9×109/L視為白細(xì)胞增多;血小板計數(shù)>600×109/L視為血小板增多。

1.3 隨訪

對所有腎癌患者進行隨訪，記錄6、12個月累計生存情況，累計生存率=生存例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以頻數(shù)及率表示，組間比較采用χ2檢驗;計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P < 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CTCs檢出情況比較

腎癌組中71例患者外周血檢出CTCs，檢出率為66.35%;檢出個數(shù)為0～18個，平均（3.02±0.26）個/mL。對照組外周血中未檢出CTCs。

2.2 外周血CTCs與病理指標(biāo)相關(guān)性分析

比較外周血CTCs檢出陽性率與各臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，T分期為3～4期患者的CTCs陽性檢出率顯著高于1～2期患者（P < 0.05）;臨床病理分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者CTCs陽性檢出率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P < 0.05）;中性粒細(xì)胞數(shù)增多患者陽性率顯著高于未增多患者（P < 0.05）。見表1。

對上述差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)，采用Logistic回歸分析進行進一步分析，結(jié)果提示T分期為CTCs陽性的獨立危險因素（P < 0.05）。見表2。

2.4 外周血CTCs與腎癌患者預(yù)后的關(guān)系

對腎癌組患者隨訪，隨訪時間為60～627 d。根據(jù)CTCs檢查結(jié)果將腎癌組分為CTCs陽性組與CTCs陰性組，對兩組預(yù)后進行比較，結(jié)果顯示CTCs陽性組生存時間短于CTCs陰性組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表3。

3 討論

腫瘤的轉(zhuǎn)移與患者預(yù)后關(guān)系密切，其具體過程以腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，轉(zhuǎn)移、定植到血液、骨髓、淋巴結(jié)及遠處器官為主，以往研究認(rèn)為惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是癌癥進展到晚期的事件，近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移在癌癥早期就已發(fā)生，CTCs散播進入外周血可能是惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的標(biāo)志及起源，其在腫瘤轉(zhuǎn)移中扮演重要作用[10-11]。CTCs對多種腫瘤的預(yù)后價值已得到諸多研究證實，明星等[12]探究CTCs在食管鱗癌中的預(yù)后價值，研究發(fā)現(xiàn)首診CTCs陰性患者的中位生存時間顯著高于首診CTCs陽性患者。Giuliano等[13]對492例晚期乳腺癌患者進行CTCs檢測，發(fā)現(xiàn)術(shù)前CTCs≥5個/7.5 mL的患者較CTCs<5個/7.5 mL的患者轉(zhuǎn)移部位多，且極易發(fā)生新的轉(zhuǎn)移病灶。Tol等[14]研究發(fā)現(xiàn)外周血CTCs>3個/7.5 mL的晚期結(jié)直腸癌患者總生存期及無進展生存期顯著短于CTCs≤3個/7.5 mL的患者。CTCs與腫瘤進展及預(yù)后關(guān)系密切，但其與腎癌的關(guān)系仍研究較少，本研究對腎癌患者及健康志愿者外周血CTCs水平進行檢測，旨在探究外周血CTCs與腎癌臨床指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系。CTCs在外周血中含量較少，大大增加CTCs的檢測難度[15]，本研究采用免疫磁珠富集及免疫熒光鑒定的方法，利用CTC的生物學(xué)特性，去除外周血非上皮來源細(xì)胞干擾，提高CTCs富集質(zhì)量。本研究中腎癌患者CTCs陽性檢出率為66.35%，而20名健康志愿者外周血中未檢測到CTCs，提示檢測效果較為可靠。

本研究對不同病理資料的患者CTCs陽性檢出率進行分析，發(fā)現(xiàn)不同分期、臨床分級患者的CTCs檢出率差異顯著，具體表現(xiàn)為高T分期、臨床病理分期患者CTCs檢出率顯著高于低T分期、病理分期患者。病理分期是根據(jù)腫瘤體積、浸潤程度等情況描述腫瘤進展情況，是癌癥的主要預(yù)后因素之一，較高的T分期預(yù)示著較為廣泛的腫瘤侵犯范圍，相較于低T分期患者來說，腫瘤細(xì)胞更易釋放于血液中[16-17]。結(jié)合本研究結(jié)果推測CTCs細(xì)胞數(shù)量與腎癌腫瘤體積及浸潤范圍相關(guān)，較高的病理分期具有更大的病灶，極易向血液中播散并形成轉(zhuǎn)移，這也是高分期患者生存預(yù)后較差的原因。臨床分期反映腫瘤轉(zhuǎn)移范圍，本研究結(jié)果顯示臨床分期與CTCs陽性檢出率相關(guān)，提示腎癌CTCs可作為早期診斷腎癌進展、轉(zhuǎn)移的指標(biāo)之一。另外本研究亦發(fā)現(xiàn)CTCs與中性粒細(xì)胞數(shù)計數(shù)增高相關(guān)，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與體內(nèi)炎癥狀態(tài)及免疫狀態(tài)間的平衡息息相關(guān)，持續(xù)的炎性反應(yīng)可促使腫瘤細(xì)胞逃脫宿主免疫反應(yīng)從而促進腫瘤遠處轉(zhuǎn)移，中性粒細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸過程的重要參與者，亦是晚期癌癥預(yù)后的預(yù)測因素之一[18-19]。為進一步探究CTCs與腎癌預(yù)后的關(guān)系，對CTCs陽性與陰性患者的生存期進行分析，結(jié)果顯示CTCs陰性患者中位生存時間長于CTCs陽性患者，Bluemke等[20]在154例腎癌患者隨訪中發(fā)現(xiàn)，CK陽性的CTCs檢出率與患者預(yù)后情況呈正相關(guān)，CK與CTCs陽性是腎癌預(yù)后的獨立危險因素;結(jié)合本研究中CTCs與腎癌分期的研究，CTCs的檢出情況可一定程度反映腫瘤生物學(xué)特性及浸潤情況，可作為判斷患者預(yù)后的輔助信息。

綜上，外周血CTCs陽性檢出率與腎癌患者T分期、臨床病理分期及中性粒細(xì)胞增加相關(guān)，其中患者T分期是外周血CTCs的獨立危險因素，外周血CTCs可作為判斷患者預(yù)后的輔助信息。

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（收稿日期：2018-05-21? 本文編輯：金? ?虹）