PCR-RFLP法檢測DDAH2基因rs805304多態(tài)性的實驗條件研究

石柔 董榮靜 劉華 李會芳

[摘要] 目的 探討聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測二甲基精氨酸二甲胺水解酶2（DDAH2）rs805304多態(tài)性的最適實驗條件。 方法 運用PCR-RFLP技術分別對2016年1月～2017年3月昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院收治的182例2型糖尿病患者和147名健康體檢者DDAH2基因rs805304的多態(tài)性進行檢測，對影響PCR-RFLP方法的主要因素進行研究。 結果 最適實驗條件：退火溫度為58℃，變性溫度為95℃，2× Power Taq PCR Master Mix濃度為12.5 μL，引物濃度為0.8 μmo/L，酶切體系為15 μL體系中加8.0 μL產物，用5 U的限制性內切酶BstUI消化。 結論 最適實驗條件的摸索為后續(xù)研究奠定了基礎。

[關鍵詞] 聚合酶鏈反應;限制性片段長度多態(tài)性;二甲基精氨酸二甲胺水解酶2;實驗條件

[中圖分類號] Q346.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（b）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the optimum experimental conditions for dimethylarginine dimethylamine hydrolase 2 （DDAH2） gene rs805304 polymorphism by polymerase chain reaction - restricted fragment length polymorphism （PCR-RFLP）. Methods The DDAH2-rs805304 locus polymorphism in 182 T2DM cases admitted to the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University from January 2016 to March 2017 and 147 healthy controls were detected by PCR-RFLP. The main factors influencing PCR-RFLP were studied. Results The optimum conditions： annealing temperature was 58℃， denaturation temperature was 95℃， 2× Power Taq PCR Master Mix concentration was 12.5 μL， primer concentration was 0.8 μmo/L， the effective system was 15 μL including 8 μL DNA solution and 5 U restriction enzyme BstUI. Conclusion The exploration of optimal experimental conditions has laid a foundation for the subsequent research.

[Key words] Polymerase chain reaction; Restricted fragment length polymorphism; Dimethylarginine dimethylamine hydrolase 2; Experimental condition

糖尿病發(fā)病率急劇增加，2017年全世界大約有4.25億人患有糖尿病[1]，其危害主要來源于其血管并發(fā)癥。非對稱性二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）被認為是內源性一氧化氮合成酶（NOS）抑制劑，人體絕大多數(shù)ADMA被二甲基精氨酸二甲胺水解酶（dimethylarginine dimethylamine hydrolase，DDAH）代謝滅活。因此，通過抑制DDAH酶活性，可影響ADMA濃度，從而抑制NOS活性，減少一氧化氮的生成，促使血管內皮功能受損，介導糖尿病動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[2]。國內外學者發(fā)現(xiàn)DDAH/ADMA/NOS通路下調與胰島素抵抗相關[3-4]，該途徑還參與糖尿病中內皮細胞的衰老[5-6]。遺傳因素可能影響體內DDAH活性，從而導致體內ADMA含量的改變[7-10]。近期研究提示DDAH2過度表達及其基因多態(tài)性可能與高血壓、胰島素抵抗相關[11-15]。然而DDAH2基因是否參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生，目前尚不清楚。本研究對聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術檢測該基因位點多態(tài)性的最適實驗條件進行系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

1.1.1 2型糖尿病患者? 選取2016年1月～2017年3月于昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）糖尿病科住院部的云南地區(qū)漢族患者，根據1999年WHO診斷標準確診的無親緣關系同時排除合并急性代謝紊亂、感染、嚴重肝腎功能不全、妊娠及其他內分泌系統(tǒng)疾病的2型糖尿病患者182例，男93例，女89例，平均年齡（55.03±11.45）歲。

1.1.2 正常對照? 選取同時期在我院進行健康體檢的無親緣關系的云南地區(qū)漢族人群，無糖尿病、高血壓家族史，且糖耐量及其他檢查結果均正常者為健康對照者，共147名，男75名，女72名，平均年齡（52.15±11.82）歲。

1.2 主要試劑

全血基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物有限公司，B518223），2× Power Taq PCR Master Mix（百泰克公司，pr1701），由上海生工生物有限公司根據人DDAH2基因組DNA序列，應用Primer軟件設計并合成PCR用的引物：上游5′-AGAGGGGATGAGGGAA-AGAA-3′，下游5′-CCTTGTGTAGGCGAGCTCAT-3′，限制性內切酶BstUI（New England Biolabs公司，R0518V）。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取? 從研究人群的外周血白細胞中用全血基因DNA提取試劑盒抽提DNA作為模板。

1.3.2 PCR實驗條件? 通過分別設定系列變性溫度梯度、退火溫度梯度、引物濃度梯度、2× Power Taq PCR Master Mix濃度梯度，最終確立最適PCR體系為：DNA模板1 μL，上、下游引物各2 μL（初濃度為10 μmo/L），2× Power Taq PCR Master Mix 12.5 μL，加入雙蒸水至25 μL。PCR擴增程序：95℃預變性5 min，之后按95℃ 45 s、58℃ 60 s、72℃ 60 s共35個循環(huán)，最后72℃延伸至5 min。

1.3.3 RFLP? 取PCR產物8 μL、20×Buffer 1.5 μL、限制性內切酶BstUI 5 U（0.5 μL），加雙蒸水至15 μL，放入水浴箱中于37℃過夜酶切（約16 h）。

1.3.4 DNA測序? 隨機選取不同基因型的PCR產物送大連寶生物公司進行測序，進一步證實酶切結果。

2 結果

2.1 最適擴增條件

2.1.1 變性溫度? 設定變性溫度梯度為92～96℃，可見95℃和96℃時較92～94℃時的產物量明顯增加，為保證Taq酶的活性，選95℃為最適變性溫度。

2.1.2 退火溫度? 設定退火溫度梯度為52～62℃，結果顯示：58～62℃時較52～56℃時產物量多，58℃時產物量適中，并且未見明顯非特異性產物，故選58℃為最適退火溫度。

2.1.3 引物濃度? 在終濃度0.2～1.0 μmo/L之間設定引物濃度梯度，電泳結果可見：引物濃度從0.2～0.8 μmo/L產物濃度逐漸增加，1.0 μmo/L產物濃度減少，選擇引物二聚體少而產物量最高的0.8 μmo/L為最適引物濃度。

2.1.4 2× Power Taq PCR Master Mix濃度? 在11.5～15.5 μL之間設定濃度梯度，結果顯示：不同濃度下產生的條帶清晰程度無明顯變化，為了節(jié)約試劑，故選擇12.5 μL為最適濃度。

2.2 RFLP體系及反應條件

酶切產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳后顯示結果清晰：無酶切位點純合子AA基因型有2條條帶（475、42 bp），有酶切位點CC基因型有3條條帶（388、87、42 bp），雜合子AC基因型有4條條帶（475、388、87、42 bp），由于小于100 bp的片段電泳后游離到膠外，故87、42 bp片段不易看見。故確定上述條件為最適酶切條件。

2.3 基因型測序分析

隨機抽取不同基因型的PCR產物各10例進行測序，結果顯示凝膠電泳結果與測序結果一致。

3 討論

對于已知點突變的研究，經典的PCR-RFLP技術是最常用的方法之一，它具有產率高、快速、簡便、特異、敏感、重復性好等優(yōu)點[16]。本研究即選用該方法對DDAH2基因rs805304多態(tài)性進行分析。影響PCR的因素很多，如果沒有找到最佳實驗條件，可能會導致產物量少、非特異性擴增產物、引物二聚體形成等，甚至出現(xiàn)假陽性或假陰性?，F(xiàn)將影響PCR-RFLP法檢測DDAH2基因rs805304多態(tài)性的主要實驗因素討論如下：

變性溫度：導致PCR失敗的主要原因之一是變性溫度過低，其可能導致解鏈不完全。但溫度也不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響[17]。一般情況下，93～96℃足以使模板DNA變性。我們在92～96℃之間設系列變性溫度，隨著溫度的提升，產物量明顯增加，同時為保證Taq酶的活性，故選95℃為最適變性溫度。

退火溫度：引物的復性溫度就是退火溫度，它的高低主要由引物的CG含量、長度決定。通常引物的解鏈溫度是可以運用公式計算得到的，而復性溫度應低于解鏈溫度的5℃。通常，隨著退火溫度的降低，擴增產量逐漸增加，但錯配現(xiàn)象可能增多;隨著復性溫度的升高，擴增的特異性逐漸提高，但擴增產量下降[18]。筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)58℃時產物量適中，并且未見明顯非特異性產物，故選58℃為最適退火溫度。

引物濃度：引物濃度不宜過高，濃度過高有兩個弊端，一是容易形成引物二聚體，二是當擴增微量靶序列并且起始材料又比較粗糙時，容易產生非特異性產物。一般來說，用低濃度引物不僅經濟，而且反應特異性也好[19]。根據說明書，筆者把引物終濃度范圍設定在0.2～1.0 μmo/L，結果均有產物擴出，引物濃度在0.8 μmo/L時，非特異性產物較少而產物量最高，為保證酶切效果，確定該濃度為最適引物濃度。

2× Power Taq PCR Master Mix濃度：該預混制劑包含Taq DNA聚合酶、優(yōu)化的Taq緩沖區(qū)、MgCl2和核苷酸。本制劑節(jié)省時間，減少污染，相比傳統(tǒng)的Taq DNA聚合酶，它確保更高的靈敏度和收益率。濃度過高會出現(xiàn)非特異擴增，過低時PCR產物量低。本研究通過設定11.5～15.5 μL范圍內的系列濃度，得出12.5 μL為最適濃度。

酶切條件：限制性核酸內切酶價格昂貴，酶切體系中加入過多的酶量，造成不必要的浪費，而酶量過少會導致電泳結果不清晰[20]。本研究按照說明書推薦的體系，顯示酶切完全，結果清晰，后減少酶切時間及BstUI用量均導致酶切效果不佳，故確定擴增產物8 μL、限制性內切酶BstUI 5 U（0.5 μL），過夜酶切16 h為最適酶切條件。

本研究確立了PCR-RFLP法檢測DDAH2基因rs805304多態(tài)性的最適實驗條件，為后續(xù)開展DDAH2基因rs805304多態(tài)性與2型糖尿病腎病的相關性研究提供了快速、特異、可靠的方法。

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（收稿日期：2018-10-08? 本文編輯：張瑜杰）