IL-6、CAT、MPO在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用

章小兵 翟淑萍 苑偉 顏勇 張北平 王百林

[摘要] 目的 探討白細(xì)胞介素-6（IL-6）、過氧化氫酶（CAT）、髓過氧化物酶（MPO）與大鼠肝臟缺血再灌注損傷（HIRI）關(guān)系及其損傷機(jī)制。 方法 選取6周齡SD大鼠150只，采用肝門部血流阻斷法制備大鼠HIRI模型。采用簡單隨機(jī)分組原則將大鼠分為HIRI組（n = 75）、缺血再灌注對照（Control）組（n = 75）;每組再分成3個(gè)亞組，分別為缺血再灌注后1 h組、3 h組、6 h組，每亞組各25只;分別在缺血再灌注后1、3、6 h抽取兩組大鼠下腔靜脈血液，檢測血清中IL-6水平;切取適量肝組織，檢測肝組織內(nèi)的CAT、MPO活性，并用以評估兩組各時(shí)間點(diǎn)HIRI情況。 結(jié)果 與Control組同期比較，HIRI組在肝臟缺血再灌注后1、3、6 h的IL-6含量、MPO活性高于Control組，但CAT活性較Control組降低（均P < 0.05）。 結(jié)論 大鼠HIRI與急性炎性細(xì)胞因子IL-6及MPO釋放增多以及與CAT釋放抑制而導(dǎo)致氧自由基清除障礙有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 肝缺血再灌注;過氧化氫酶;白細(xì)胞介素-6;髓過氧化物酶

[中圖分類號] R657.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（c）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between interleukin-6 （IL-6）， catalase （CAT）， myeloperoxidase （MPO） and hepatic ischemia-reperfusion injury （HIRI） in rats and its mechanism. Methods A total of 150 SD rats aged 6 weeks were selected and the HIRI model was established by blocking hepatic portal blood flow. Rats were divided into HIRI group （n = 75） and liver ischemia-reperfusion （Control） group （n = 75）. Each group was divided into three subgroups： 1 h group， 3 h group and 6 h group after ischemia-reperfusion， with 25 rats in each subgroup. The inferior vena cava blood of the two groups were extracted at 1， 3 and 6 h after ischemia-reperfusion to detect the level of IL-6 in serum. The appropriate amount of liver tissue was cut， the activities of CAT and MPO in liver tissue were measured， and the situations of HIRI were evaluated at each time point in the two groups. Results Compared with the Control group， IL-6 and MPO activities in the HIRI group were higher than those in the Control group at 1， 3， and 6 h after hepatic ischemia-reperfusion， but the CAT activity was lower than that in the Control group （all P < 0.05）. Conclusion The HIRI in rats is associated with the increase of IL-6 and MPO as well as with oxygen free radical scavenging disturbance caused by inhibition of CAT release.

[Key words] Hepatic ischemia-reperfusion; Catalase; Interleukin-6; Myeloperoxidase

肝臟缺血再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是發(fā)生在肝切除或者肝臟移植術(shù)后的一種病理生理反應(yīng)，明顯影響到肝功能及預(yù)后。肝血流阻斷法是肝臟外科中常用的手術(shù)技巧，可用于控制術(shù)中大出血，降低輸血率。雖然肝血流阻斷技術(shù)能有效地控制術(shù)中出血，但同時(shí)也不可避免地帶來了HIRI損傷的副作用。HIRI損傷能夠誘導(dǎo)氧自由基的激活，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞死亡，最終引起無菌性炎性反應(yīng)，使肝細(xì)胞損傷和肝功能受損，嚴(yán)重的還會導(dǎo)致急性肝功能衰竭。目前，臨床上仍缺乏預(yù)防和治療HIRI的有效辦法，且其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究[1-4]。肝臟缺血后早期發(fā)生的快速氧化還原反應(yīng)是已知的損傷機(jī)制之一，這一過程主要由肝細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)，晚期還和肝組織中淋巴細(xì)胞浸潤、細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)[5-6]。因此，研究HIRI的機(jī)制具有一定的臨床意義。本研究通過建立HIRI大鼠模型，檢測大鼠血清中白細(xì)胞介素-6（IL-6）含量及肝組織勻漿中過氧化氫酶（CAT）、髓過氧化物酶（MPO）的活性，探討HIRI機(jī)制，為預(yù)防其損傷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? 選取6周齡SD大鼠150只，體重250～300 g，均購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄不限，動(dòng)物合格證編號：SCXK（粵）2013-0020，飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室溫度為22～24℃，濕度40%～60%，自由進(jìn)食、進(jìn)水，適應(yīng)新環(huán)境1周。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑? IL-6 ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司（生產(chǎn)批號：CSB-E04640r）;過氧化氫酶測試盒和髓過氧化物酶測試盒均購自南京建成生物工程研究所（生產(chǎn)批號：A044、A007-1）。

1.1.3儀器? Scanspeed 1730R低溫離心機(jī)（丹麥LaboGene公司）;DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;DK-8D電熱恒溫水槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;752型紫外-可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）;iMark酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 分組? 按簡單隨機(jī)分組原則將150只SD大鼠分為HIRI組（n = 75）、缺血再灌注對照（Control）組（n = 75）;每組再分成3個(gè)亞組，分別是缺血再灌注后1 h組、3 h組、6 h組，每亞組各25只。

1.2.2 建立模型與取材? 造模12 h前開始禁食、3 h前開始禁水，對每只實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行稱重、編號。配制1%水合氯醛，按1 mL/100 g對大鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉后，參照余淑珍等[7]改良SD大鼠急性HIRI制備方法制備動(dòng)物模型。具體操作：HIRI組以無損傷血管夾阻斷肝門30 min，其后松開血管夾，恢復(fù)血流，模擬大鼠肝臟缺血后再灌注。Control組大鼠僅切開腹壁，顯露肝門，不進(jìn)行肝門阻斷，其他手術(shù)過程同HIRI組。4-0細(xì)絲線逐層關(guān)腹，電熱毯加熱復(fù)溫。分別于術(shù)后1、3、6 h對各亞組大鼠進(jìn)行取材，各亞組每只大鼠每次抽取下腔靜脈血1 mL;切取適量肝組織制備勻漿液，3000 r/min離心20 min，收集上清液，置入-80℃冰箱中保存待測。

1.3 檢測指標(biāo)

分別用IL-6試劑盒、CAT試劑盒、MPO試劑盒檢測血清IL-6表達(dá)水平和肝組織中的CAT和MPO活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HIRI組大鼠肝臟缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)的血清中IL-6含量、肝組織勻漿液中MPO活性明顯高于Control組同期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。HIRI組大鼠肝臟缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)的肝組織勻漿液中CAT活性明顯低于Control組同期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

3 討論

肝切除術(shù)和肝移植術(shù)在臨床上已被廣泛采用來治療肝臟疾病。術(shù)中為控制出血，各種肝血流阻斷方法應(yīng)運(yùn)而生。自1908年澳大利亞外科醫(yī)生Pringle第一次通過壓迫肝十二指腸韌帶阻斷門靜脈和肝動(dòng)脈血流為一位因外傷致肝挫裂傷的患者手術(shù)止血[8-9]至今，肝臟外科已獲得長足進(jìn)步。然而，HIRI仍然是制約肝臟外科發(fā)展的主要問題之一，HIRI不只是發(fā)生于肝臟本身的病理生理過程，還是一個(gè)影響多種組織和器官功能的全身性、復(fù)雜性反應(yīng)。其能夠嚴(yán)重影響肝功能，甚至產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷，引起多器官瀑布式功能障礙。其病理生理過程復(fù)雜，機(jī)制尚未清晰。已知的機(jī)制包括鈣超載線粒體通透轉(zhuǎn)換孔道、氧化應(yīng)激、HIRI相關(guān)炎性細(xì)胞因子、核轉(zhuǎn)錄因子、熱休克蛋白、一氧化氮等。目前，其研究主要集中在多種炎性因子釋放、氧自由基損傷、中性粒細(xì)胞黏附和過度活化及肝臟微循環(huán)障礙等學(xué)說[10-11]。

HIRI涉及肝臟炎性反應(yīng)，如多種炎性細(xì)胞因子如IL-6、MPO和氧自由基清除障礙等[12]。HIRI氧自由基生成增多和清除障礙有關(guān)[13-14]。

IL-6是屬于白細(xì)胞介素，它是由IL-6基因編碼、由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子，同時(shí)也是抗炎肌動(dòng)蛋白。其在炎癥、創(chuàng)傷、惡性腫瘤等多種急慢性炎性反應(yīng)中表達(dá)增多[15-16]。肝臟發(fā)生缺血再灌注時(shí)，組織內(nèi)的氧自由基可通過多種機(jī)制導(dǎo)致IL-6爆發(fā)性水平升高。此外，F(xiàn)aitot等[16]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6能夠反映細(xì)胞溶解，有助于預(yù)測肝移植術(shù)術(shù)后早期血管相關(guān)性并發(fā)癥，也是預(yù)測肝移植術(shù)后遠(yuǎn)期生存率的可靠生物標(biāo)志物。

MPO與體內(nèi)中性粒細(xì)胞的功能和激活有關(guān)，MPO的含量和活性大小反映了嗜中性多形核白細(xì)胞（PMN）的功能和活性程度[17-18]。本研究中HIRI組缺血再灌注后1、3、6 h大鼠血清中IL-6含量和肝組織勻漿液中MPO活性顯著高于Control組同期（P < 0.05），提示大鼠HIRI的發(fā)生可能與多種炎性細(xì)胞因子釋放、中性粒細(xì)胞黏附和過度活化相關(guān)。

氧自由基的生成是HIRI中重要的原因之一，有效清除氧自由基可明顯減輕HIRI[19]。CAT是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一，可使得過氧化氫（H2O2）分解為氧和水，阻止羥自由基的生成，減少H2O2對細(xì)胞毒害[20]。CAT在肝臟中濃度較高。本研究中，與Control組比較，HIRI組在缺血再灌注后1、3、6 h大鼠肝組織勻漿液中CAT活性明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示HIRI發(fā)生后，機(jī)體對氧自由基清除可能發(fā)生障礙。

綜上所述，HIRI發(fā)生機(jī)制與HIRI后IL-6過表達(dá)和CAT及MPO含量變化有關(guān)。因此，抑制炎性細(xì)胞因子的過度表達(dá)、加速體內(nèi)氧自由基的清除，可能是保護(hù)肝切除或肝移植術(shù)后肝臟功能的重要治療性策略。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Olthof PB，Golen RFV，Meijer B，et al. Warm ischemia time-Dependent variation in liver damage，inflammation，and function in hepatic ischemia/reperfusion injury [J]. Bioehim Biophys Acta，2017，1863（2）：375-385.

[2]? 李偉男，彭慈軍，舒德軍.肝臟缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2015，23（22）：3554-3559.

[3]? van Riel WG，van Golen RF，Reiniers MJ，et al. How much ischemia can the liver tolerate during resection？[J]. Hepatobiliary Surg Nutr，2016，5（1）：58.

[4]? Guan LY，F(xiàn)u PY，Li PD，et al. Mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and protective effects of nitric oxide [J]. World J Gastrointest Surg，2014，6（7）：122-128.

[5]? Husted TL，Lentsch AB. The role of cytokines in pharmacological modulation of hepatic ischemia/reperfusion injury [J]. Curr Pharm Des，2006，12（23）：2867-2873.

[6]? Eliasmiró M，Jiménezcastro MB，Rodés J，et al. Current knowledge on oxidative stress in hepatic ischemia/reperfusion [J]. Free Radic Res，2013，47（8）：555-568.

[7]? 余淑珍，郭永清，鄭李娜，等.SD大鼠急性全肝缺血再灌注模型建立與改良[J].中國藥物與臨床，2016，16（1）：28-30.

[8]? Liu A，F(xiàn)ang H，Dahmen U，et al. Chronic lithium treatment protects against liver ischemia/reperfusion injury in rats [J]. Liver Transpl，2013，19（7）：762-772.

[9]? Pringle JH. V.Notes on the Arrest of Hepatic Hemorrhage Due to Trauma [J]. Ann Surg，1908，48（4）：541-549.

[9]? Elias-Miró M，Jiménez-Castro MB，Rodés J，et al. Current knowledge on oxidative stress in hepatic ischemia/reperfusion [J]. Free Radic Res，2013，47（8）：555-568.

[10]? 彭方毅，李波.肝缺血再灌注損傷機(jī)制及相應(yīng)保護(hù)措施的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2015（12）：1821-1823.

[11]? Zhou W，Zhang Y，Hosch MS，et al. Subcellular site of superoxide dismutase expression differentially controls AP-1 activity and injury in mouse liver following ischemia/reperfusion [J]. Hepatology，2001，33：902.

[12]? 王百林，苑偉，翟淑萍，等.利膽消黃湯對梗阻性黃疸兔肝細(xì)胞線粒體DNA損傷修復(fù)的研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2015，32（11）：2636-2638.

[13]? 王百林，苑偉，翟淑萍，等.梗阻性黃疸兔肝細(xì)胞線粒體氧化損傷的作用及機(jī)制[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2014， 31（11）：2393-2395.

[14]? Fergusonsmith AC，Chen YF，Newman MS，et al. Regional localization of the interferon-beta 2/B-cell stimulatory factor 2/hepatocyte stimulating factor gene to human chromosome 7p15-p21 [J]. Genomics，1988，2（3）：203-208.

[15]? Van d PT，Keogh CV，Guirao X，et al. Interleukin-6 gene-deficient mice show impaired defense against pneumococcal pneumonia [J]. J Infect Dis，1997，176（2）：439-44.

[16]? Faitot F，Besch C，Lebas B，et al. Interleukin 6 at reperfusion： a potent predictor of hepatic and extrahepatic early complications after liver transplantation [J]. Clin Transplant，2018，25：e13357.

[17]? Clavien PA. Sinusoidal endothelial cell injury during hepatic preservation and reperfusion [J]. Hepatology，1998， 28：281-285.

[18]? Gao W，Bentley RC，Madden JF，et al. Apoptosis of sinusoidal endothelial cells is a critical mechanism of preservation injury in rat liver transplantation [J]. Hepatology，1998，27：1652-1660.

[19]? Jaeschke H，Woolbright BL. Current strategies to minimize hepatic ischemia-reperfusion injury by targeting reactive oxygen species [J]. Transplant Rev，2012，26（2）：103-114.

[20]? Bhogal RH，Sutaria R，Afford SC. Hepatic liver ischemia/reperfusion injury：processes in inflammatory networks——a review [J]. Liver Transpl，2010，16（9）：1016-1032.

（收稿日期：2018-05-22? 本文編輯：王? ?蕾）