共焦顯微鏡在角膜病變中應(yīng)用的新進展

鄭 巧，張 琪

0引言

共焦顯微鏡(confocal microscopy, CM)檢查作為一種“活體組織學(xué)檢查”方法，以其實時、無創(chuàng)、快速、高清的特點，已在眼科臨床及科研中得到廣泛應(yīng)用。其放大倍率可達800倍，分辨率可達1μm，能夠從細胞水平對活體角膜組織進行觀察，在角膜生理、病理研究及疾病診斷、病情評估、隨訪等方面顯示出優(yōu)越性。

1共焦顯微鏡在感染性角膜疾病中的應(yīng)用

1.1真菌性角膜炎真菌性角膜炎(fungal keratitis, FK)近年發(fā)病率呈上升趨勢，其病程遷延，是導(dǎo)致角膜盲的常見原因，早期診斷并啟動有效的抗真菌治療是改善其預(yù)后的重要因素。角膜刮片鏡檢及培養(yǎng)是FK診斷的金標準，但絲狀真菌生長緩慢，其培養(yǎng)可能需數(shù)周，且敏感性低，陽性率不到50%[1]。角膜組織病理學(xué)檢查及PCR技術(shù)已用于診斷FK，但限于其侵入性，難以早期實施。CM可無創(chuàng)、快速的檢測角膜中的真菌。CM下真菌菌絲多呈高反光的線型結(jié)構(gòu)，可見分節(jié)或分支，呈竹節(jié)狀或樹枝狀，叢狀雜亂排列。鐮刀菌屬分支夾角多為90°，曲霉菌屬多為45°，據(jù)此可做出初步鑒別。孫曉會等[2]對比分析了CM與角膜刮片鏡檢在FK診斷中的作用，發(fā)現(xiàn)CM有更高的陽性診斷率，觀察到的菌絲和孢子與角膜刮片檢查所見相似，對于病程較長，已使用抗真菌藥物或已行病灶刮除等治療的患者，兩者診斷敏感度均下降。有學(xué)者就檢查者經(jīng)驗在CM診斷FK中的影響做了研究，發(fā)現(xiàn)有經(jīng)驗的檢查者診斷的平均敏感度為71%，缺乏經(jīng)驗的檢查者為43%，所有檢查者診斷的特異性為75%或更高，顯示檢查者經(jīng)驗在CM的診斷準確性中扮演重要角色。目前，CM的分辨率還不能滿足對真菌微細結(jié)構(gòu)的觀察，無法準確鑒別菌種。近期Chidambaram等[3]使用CM觀察不同病原體所致FK的角膜細胞變化，發(fā)現(xiàn)前基質(zhì)星狀細胞與鐮刀菌性角膜炎相關(guān)，樹突狀細胞與曲霉菌性角膜炎相關(guān)，提示角膜細胞的反應(yīng)可能具有一定特異性，為菌種鑒別提供線索。

1.2棘阿米巴性角膜炎棘阿米巴性角膜炎(acanthamoeba keratitis, AK)由棘阿米巴原蟲感染所致，較真菌性角膜炎、細菌性角膜炎等少見，近年隱形眼鏡使用的增加使其發(fā)病率明顯上升，隨地區(qū)不同，每10000名隱形眼鏡配戴者有0.01～1.5名感染棘阿米巴原蟲[4-5]。由于早期臨床表現(xiàn)缺乏特征性，AK常被誤診為單純皰疹病毒性角膜炎、細菌性角膜炎或真菌性角膜炎[6-7]。據(jù)報道，在培養(yǎng)物中分離出棘阿米巴的概率為0～68%[8]。棘阿米巴有滋養(yǎng)體和包囊兩種形態(tài)，體積均較大(>10μm),在CM下呈圓形或卵圓形、高反光，易于檢出。1992年Chew等[9]首次報道通過CM診斷AK。此后許多研究者研究并肯定了CM對AK的診斷意義，但報道的診斷靈敏度、特異性不一。王玉亭[10]回顧分析了58例AK，發(fā)現(xiàn)CM的檢出率為86.4%，其中32例根據(jù)CM確定的感染范圍切除病灶，實施角膜移植術(shù)，取得滿意效果。據(jù)文獻報道，棘阿米巴包囊可長期存留于角膜組織中，最長達31mo，角膜炎癥控制后仍需藥物治療3～4mo[11]。感染后期角膜上皮愈合，此時可利用CM隨訪觀察，指導(dǎo)治療。現(xiàn)有研究對棘阿米巴在CM下的表現(xiàn)描述各異。近期Craene等[12]首次參照PCR對CM診斷AK的價值進行了評估并研究了其診斷標準，認為4種影像與AK顯著相關(guān)：亮點(沒有雙壁結(jié)構(gòu)的圓形或卵形高反射物)，目標圖像(具有低反射光暈的高反射物)，滋養(yǎng)體樣圖像(直徑>30μm，表面呈棘狀突起的高反射物)和高反射物體簇。其中目標圖像和滋養(yǎng)體樣圖像診斷特異性最高，為100%，但敏感性最低，分別為8.7%和10.9%，因此需要尋找多方面證據(jù)確定診斷。Chidambaram等[3]發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)體樣圖像可形成簇，尤其在局部類固醇治療后的病例。Zhang等[13]對29例AK進行觀察，發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)體樣圖像的線性或成簇排列與預(yù)后不良相關(guān)。另有研究者在病程較長的AK中觀察到滋養(yǎng)體樣圖像簇狀排列，且比例很高，這些患者曾使用局部類固醇治療[14]。滋養(yǎng)體樣圖像的簇狀排列是否是AK有用的預(yù)后指標還需要更大量的研究確定。這些研究提示，CM可能提供診斷以外的更多信息。

1.3病毒性角膜炎單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)是發(fā)達國家最常見的感染致盲原因[15]。原發(fā)性角膜感染后，單純皰疹病毒進入三叉神經(jīng)節(jié)，終生潛伏并周期性激活，引起復(fù)發(fā)性HSK[16]。其嚴重并發(fā)癥之一是神經(jīng)營養(yǎng)性角膜病變[17]。CM雖然無法分辨病毒，但可用于HSK的病理研究。Müller等[18]使用CM觀察HSK后角膜瘢痕形成眼及對側(cè)臨床未受累眼，發(fā)現(xiàn)瘢痕眼角膜內(nèi)皮細胞密度、總神經(jīng)長度顯著低于健康對照組，對側(cè)眼亦相應(yīng)降低，兩者角膜內(nèi)皮細胞密度與總神經(jīng)長度、角膜知覺呈正相關(guān)，推測單側(cè)HSK后，雙側(cè)角膜神經(jīng)受損，神經(jīng)肽水平降低，內(nèi)皮細胞損失。

2共焦顯微鏡在變性性角膜疾病中的應(yīng)用

2.1角膜營養(yǎng)不良角膜營養(yǎng)不良包括一大類與家族遺傳有關(guān)的原發(fā)性進行性角膜疾病，以角膜異常物質(zhì)沉積為共同特征，表現(xiàn)各異，根據(jù)主要受累層次分為上皮和上皮下營養(yǎng)不良、上皮-基質(zhì)TGFBI營養(yǎng)不良、基質(zhì)營養(yǎng)不良和內(nèi)皮營養(yǎng)不良四類。CM是觀察CD組織特征的有用工具。Meesmann角膜營養(yǎng)不良主要累及上皮層，表現(xiàn)為上皮囊泡樣病變，囊泡突起或破裂后引起眼部不適，可被誤診為干眼。CM下其上皮細胞間存在多量圓形或卵圓形囊泡，大小不一，邊界清晰，多呈高反光，內(nèi)部可含高反光結(jié)構(gòu)，亦可見單獨的高反光結(jié)構(gòu)散在于細胞間，在病變區(qū)域與正常區(qū)域間可見明顯的分界[19]。顆粒狀角膜營養(yǎng)不良屬上皮-基質(zhì)TGFBI營養(yǎng)不良一類，表現(xiàn)為Bowman 膜下及淺基質(zhì)層內(nèi)白色顆粒狀物質(zhì)沉著，逐漸融合成片，形成盤狀、雪花狀等外觀[20]。CM下可見Bowman 膜不規(guī)則增厚，反光增強，基質(zhì)層結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)大片高反光，其間可見短棒狀強反光結(jié)構(gòu)。Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良(Fuchs’ endothelial corneal dystrophy，F(xiàn)ECD)是較常見的一種CD，相關(guān)研究較多。遺傳突變和環(huán)境觸發(fā)因素如氧化應(yīng)激等引起內(nèi)皮細胞凋亡，異常膠原沉積，后彈力膜增厚，滴狀贅疣形成，最終導(dǎo)致角膜水腫和視力下降[21-22]。利用CM對FECD進行分級，與臨床主觀分級有很好的相關(guān)性，CM可作為FECD研究的有用工具[23]。FECD患者角膜基底膜下神經(jīng)形態(tài)異常，敏感性下降。幾項研究顯示晚期FECD角膜神經(jīng)減少或缺失，認為其歸因于角膜水腫[23-24]。 Aggarwal等[25]通過前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ECD大多數(shù)神經(jīng)改變已經(jīng)存在于早期，伴有樹突細胞(dendritic cell, DC)顯著增加，顯示免疫激活和神經(jīng)缺失可能參與FECD的發(fā)病機制。研究表明，F(xiàn)ECD前角膜結(jié)構(gòu)和細胞在早期出現(xiàn)異常，這解釋了為什么角膜后彈力層剝除聯(lián)合深板層內(nèi)皮移植術(shù)(descemet’s stripping endothelial keratoplasty, DSEK)后角膜結(jié)構(gòu)和光學(xué)功能不能恢復(fù)正常[26]。隨著技術(shù)進步，更精準的DSEK帶來更好的預(yù)后，此時宿主角膜早期的亞臨床變化與術(shù)后視覺結(jié)果更加相關(guān)。Amin等[27]使用CM觀察角膜基質(zhì)細胞密度、數(shù)量及異常上皮下細胞，根據(jù)共焦圖像光強度分布測量角膜背向散射，發(fā)現(xiàn)FECD各期患者的前角膜背向散射升高，基質(zhì)細胞密度和前10%角膜基質(zhì)細胞絕對數(shù)降低，可見異常上皮下細胞，這些改變在DSEK后持續(xù)存在，影響術(shù)后視力和視覺質(zhì)量[28]。對這些變化的深入研究可能有助于揭示FECD的最佳干預(yù)時間。

2.2圓錐角膜圓錐角膜是一種雙側(cè)性、進行性、角膜擴張性疾病，由于不規(guī)則散光或角膜混濁損害視力，晚期常需角膜移植[29]。其病因目前尚不清楚，可能涉及許多因素，包括生化、遺傳和環(huán)境。早期診斷圓錐角膜有賴于角膜地形圖，其通過計算機圖像處理系統(tǒng)精確分析整個角膜表面的形態(tài)和曲率的變化，診斷靈敏度、特異度高。CM從組織學(xué)角度觀察角膜，可發(fā)現(xiàn)圓錐角膜的早期改變，如后基質(zhì)層出現(xiàn)褶皺樣暗紋、細胞拉長等，與角膜地形圖具有良好的互補性。此外，CM在圓錐角膜治療方法的探索上具有重要價值。角膜膠原交聯(lián)(corneal collagen cross-linking, CXL)是治療圓錐角膜的一種成熟技術(shù)，已被證明可以減緩或阻止其進展，具有長期的安全性和有效性，為避免紫外線對內(nèi)皮造成不可逆損傷，常規(guī)CXL要求去除上皮后角膜厚度在400μm以上[30]。近年有學(xué)者提出，可通過增加功能性角膜厚度來擴展適應(yīng)證[31]。Mazzotta等[32]對圓錐角膜患者施行隱形眼鏡輔助的角膜膠原交聯(lián)(contact lens assisted collagen cross-linking, CACXL)：將隱形眼鏡浸泡于核黃素30min, 在照射紫外線前將其覆蓋于角膜表面，以增加功能性角膜厚度至400μm以上。術(shù)后使用CM隨訪觀察，術(shù)后3mo，患者角膜神經(jīng)開始再生，到術(shù)后6mo，角膜神經(jīng)完全修復(fù)，前基質(zhì)細胞再生，周圍分布致密細胞外基質(zhì)，水腫消失，隨訪期內(nèi)內(nèi)皮細胞規(guī)則，密度無明顯改變，顯示CACXL可能是薄圓錐角膜安全有效的治療選擇。治療范圍上，國內(nèi)外學(xué)者也做了探索。Cassagne等[33]對比分析了地形圖引導(dǎo)的角膜膠原交聯(lián)(topography-guided CXL, TG-CXL)與常規(guī)CXL對進展期圓錐角膜的療效和安全性。TG-CXL組根據(jù)角膜地形圖設(shè)計紫外線照射部位：以后角膜最高點為中心，包含前角膜異常軸向曲率范圍的錐形區(qū)域。術(shù)后通過CM發(fā)現(xiàn)TG-CXL組錐形區(qū)域和周圍區(qū)域間存在一模糊的分界線，周圍區(qū)域具有更輕微的去神經(jīng)和細胞凋亡現(xiàn)象，恢復(fù)得更快——TG-CXL具有更顯著的平坦效應(yīng)，誘導(dǎo)錐體和周圍區(qū)域間的生物學(xué)梯度，促進神經(jīng)和細胞恢復(fù)，提高視敏度。Mastropasqua等[34]對10例晚期穩(wěn)定圓錐角膜患者施行飛秒激光輔助的基質(zhì)透鏡植入術(shù)，術(shù)后以CM觀察透鏡的存活情況，到術(shù)后6mo，透鏡內(nèi)大部分細胞形態(tài)趨于正常，呈規(guī)則明亮的反光，細胞外組織呈正常的透明性，顯示基質(zhì)透鏡已很好的整合于宿主角膜，肯定了該手術(shù)方式的有效性。

3共焦顯微鏡在全身疾病所致角膜病變中的應(yīng)用

3.1糖尿病周圍神經(jīng)病變糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病的主要長期并發(fā)癥之一，發(fā)病率在50%以上，嚴重威脅患者生存質(zhì)量[35]。表皮內(nèi)神經(jīng)纖維密度(intra-epidermal nerve fiber density, IENFD)是評估小神經(jīng)纖維病變的金標準，對早期診斷DPN有重要意義，但有創(chuàng)性限制了其在DPN診斷和研究中的應(yīng)用。角膜富含末梢神經(jīng)，是DPN重要受累部位之一。糖尿病患者角膜神經(jīng)纖維密度下降，與IENFD改變顯著相關(guān)[36]。研究表明，CM具有與IENFD相當?shù)脑\斷性能，可檢測小神經(jīng)纖維的早期病變，有良好的重復(fù)性，具有快速和無創(chuàng)的優(yōu)勢[37]。近期的一項薈萃分析匯總分析了13項研究，包括1680例受試者，獨立證實了角膜神經(jīng)纖維密度、長度及其分支密度是區(qū)分有或沒有DPN的糖尿病患者與健康對照者的最佳參數(shù)[38]。Lovblom等[39]報道，隨訪1型糖尿病患者約4a，DPN發(fā)生率為17%，基線角膜神經(jīng)纖維長度小于14.9mm/mm2是發(fā)生DPN的最強預(yù)測因素。

3.2干燥綜合征干燥綜合征(Sj?gren syndrome, SS)是一類主要累及唾液腺和淚腺的慢性、炎癥性、自身免疫性疾病，包括原發(fā)性和繼發(fā)性兩類。眼表炎癥是干眼的關(guān)鍵事件。Hitomi等[40]利用CM觀察發(fā)現(xiàn)，SS相關(guān)干眼的角結(jié)膜炎癥細胞密度較非SS相關(guān)干眼顯著增高。通過CM測量的角膜背向散射已被證明是評估不同臨床情況下角膜炎癥的有效參數(shù)[41-42]。Lanza等[43]報道，原發(fā)性干燥綜合征相關(guān)干眼患者的角膜背向散射較健康對照組顯著增高。這些研究均顯示SS相關(guān)干眼存在更高水平的眼表炎癥。

3.3慢性移植物抗宿主病同種異體造血干細胞移植(hematopoietic stem cell tansplantation, HSCT)后，30%～70%的患者發(fā)生慢性移植物抗宿主病(chronic graft-vs-host disease, cGVHD)[44]，其中60%～90%累及眼睛[45]。cGVHD眼部病變表現(xiàn)多樣，最常見的形式是干眼，發(fā)生率為40%～76%[45-46]。He等[47]利用CM觀察發(fā)現(xiàn)cGVHD相關(guān)干眼患者角膜緣上皮DC密度和中央角膜球狀免疫細胞密度顯著高于無GVHD的HSCT受者，顯示cGVHD相關(guān)干眼患者眼表面的免疫激活和炎癥程度較高，兩者可作為cGVHD相關(guān)干眼患者眼表損傷和炎癥嚴重程度的可靠指標。Kheirkhah等[48]道，CM下，cGVHD相關(guān)干眼的角結(jié)膜細胞變化與具有相同疾病嚴重程度的非GVHD相關(guān)干眼患者相似。Tepelus等[49]也觀察到兩者的CM表現(xiàn)沒有顯著差異。因此，cGVHD相關(guān)干眼的角結(jié)膜改變可能只代表了局部疾病嚴重程度。

綜上所述，CM以無創(chuàng)的方式將對角膜的觀察深入到微觀，提供更加客觀、真實的信息，在感染性角膜疾病、變性性角膜疾病及全身疾病所致角膜病變中具有獨特的應(yīng)用價值。然而，隨著疾病研究的深入，CM應(yīng)用越來越廣泛的同時，也顯現(xiàn)出一些不足：(1)操作相對復(fù)雜，學(xué)習(xí)曲線較長,需要患者良好的配合；(2)重復(fù)定位較難；(3)無法準確鑒別病原體及細胞等的種類，無法分辨細菌、病毒等體積更微小的病原體。未來，隨著技術(shù)進步，操作更簡便、定位更準確、分辨率更高的CM將具有更加廣闊的應(yīng)用前景。