胎盤外泌體在子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不全相關(guān)妊娠并發(fā)癥中的作用

徐欣然，王妍平，崔洪艷

外泌體（exosomes）是細(xì)胞主動(dòng)分泌的直徑40～ 100 nm的囊泡，是細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵分子，細(xì)胞將多種分子內(nèi)容物包裹入外泌體，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、微小 RNA（miRNA）等[1]，并通過這些內(nèi)容物作用于靶細(xì)胞。外泌體的發(fā)現(xiàn)更新了細(xì)胞間信息的傳遞途徑。胎盤來源的外泌體與其他細(xì)胞來源的外泌體相較，不同之處在于其特異性地表達(dá)耐熱堿性磷酸酶（PLAP）、人白細(xì)胞抗原 G（HLA-G）和人 19號(hào)染色體miRNA族（C19MC）[2]。早在妊娠6周，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞就向母體血循環(huán)中釋放外泌體，且外泌體在母血中的濃度隨孕周增加而增加。胎盤外泌體代表了胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞與母體細(xì)胞作用的另一通路，促進(jìn)母體對(duì)妊娠的適應(yīng)性改變。在螺旋動(dòng)脈重鑄不全相關(guān)妊娠并發(fā)癥中，胎盤外泌體也可能會(huì)發(fā)生濃度和功能的變化。

1 外泌體概述

外泌體具有類似于細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)。在蔗糖溶液中位于1.13～1.19 g/mL密度層。外泌體在透射電鏡下是杯狀的，在體液中呈球形，可由多種細(xì)胞分泌，如紅細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、樹突細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、胎盤細(xì)胞等。大多數(shù)體液中可以檢測(cè)到外泌體，如血液、尿液、羊水和乳汁等[1]。

不同細(xì)胞來源的外泌體具有共同的蛋白質(zhì)與RNA組分。具有參與細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移、血管新生、免疫反應(yīng)和腫瘤生長等作用。很多研究證實(shí)，外泌體是細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵分子。蛋白質(zhì)組分主要包括膜轉(zhuǎn)運(yùn)與融合相關(guān)蛋白[小G蛋白（RabGTPases）、膜聯(lián)蛋白（Annexins）、脂閥結(jié)構(gòu)蛋白（Flotillin）等]，多囊泡胞內(nèi)體產(chǎn)生的相關(guān)蛋白 [多囊泡核內(nèi)體蛋白（Alix）、腫瘤易感基因 101蛋白（TSG101）等]，分子伴侶[熱休克蛋白 70（HSP70）、HSP90 等]，整合素，四次跨膜蛋白（CD63、CD9、CD81、CD82等）。RNA 組分主要包括mRNA（在受體細(xì)胞中翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)），miRNA（通過降解或抑制mRNA的翻譯來調(diào)控蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的表達(dá)），小干擾RNA（siRNA，敲除靶細(xì)胞中的目標(biāo)基因，達(dá)到基因沉默的作用）。外泌體作用于靶細(xì)胞的方式有3種，一是直接激活靶細(xì)胞表面受體，二是影響靶細(xì)胞外環(huán)境，三是直接進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)部釋放活性物質(zhì)[3]。

外泌體攜帶的多種分子能夠反映其來源細(xì)胞的生理狀態(tài)和功能狀態(tài)，可用于疾病診斷。而且，外泌體作為一種細(xì)胞間信息傳遞的運(yùn)輸工具，能夠達(dá)到臨近或遠(yuǎn)處細(xì)胞的細(xì)胞間隙，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞生物活性，因此可以作為藥物的納米載體對(duì)異常細(xì)胞進(jìn)行治療[4-5]。

2 胎盤外泌體

2.1 胎盤外泌體的組成胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞均可分泌外泌體，其中絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞（EVT）是胎盤錨定的基礎(chǔ)，是子宮螺旋動(dòng)脈重鑄以及防止母體對(duì)同種異體胚胎和胎盤組織產(chǎn)生免疫攻擊的關(guān)鍵細(xì)胞，所以目前胎盤外泌體的基礎(chǔ)研究主要集中在EVT。妊娠早期，EVT形成栓子堵塞螺旋動(dòng)脈與母體循環(huán)直接接觸，在妊娠9～11周解除堵塞開始螺旋動(dòng)脈重鑄，至妊娠18～20周重鑄完成。這期間與母血直接接觸的胎盤細(xì)胞主要為EVT，所以在妊娠早中期母體循環(huán)中的胎盤外泌體主要來源于EVT[6-7]。為了促進(jìn)母體免疫耐受，EVT特異性表達(dá)HLA-G，可作為蛻膜自然殺傷（dNK）細(xì)胞表達(dá)的殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIR）的配體，以免被dNK細(xì)胞殺傷。用HLA-G抗體通過蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）可以確定待檢測(cè)的外泌體是否為EVT來源[8]。

妊娠中期螺旋動(dòng)脈重鑄完成后，主要由合體滋養(yǎng)細(xì)胞執(zhí)行胎盤功能，包括物質(zhì)交換，合成維持妊娠的激素，胎盤屏障和免疫耐受等。合體滋養(yǎng)細(xì)胞在絨毛間隙與母血充分接觸，PLAP是合體滋養(yǎng)細(xì)胞特異性產(chǎn)生的，在非妊娠婦女血漿中無法檢測(cè)出PLAP[9]。合體滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體也特異性表達(dá)PLAP，用PLAP抗體通過Western blotting可以確定待檢測(cè)的外泌體是否為合體滋養(yǎng)細(xì)胞來源。

2.2 胎盤外泌體的功能

2.2.1 胎盤外泌體在子宮螺旋動(dòng)脈重鑄中的作用 由于EVT的主要功能是重鑄子宮螺旋動(dòng)脈，所以其外泌體的主要靶細(xì)胞為螺旋動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和母體免疫細(xì)胞。在正常妊娠過程中，EVT與母體細(xì)胞的聯(lián)系是外泌體介導(dǎo)的，而且外泌體的作用是氧濃度依賴的[10]。

有研究用HTR-8/SVneo細(xì)胞作為EVT模型，在8%的氧濃度下（模擬生理環(huán)境）培養(yǎng)該細(xì)胞釋放的外泌體具有促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移，從而促進(jìn)血管形成的作用；而在1%的氧濃度下（模擬子癇前期環(huán)境）培養(yǎng)該細(xì)胞釋放的外泌體具有抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用，而且誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放更多的腫瘤壞死因子α（TNF-α）。有研究表明低濃度的TNF-α促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖，而高濃度的TNF-α抑制滋養(yǎng)細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，影響血管形成[11]。表明低氧條件下EVT分泌的外泌體不利于子宮螺旋動(dòng)脈重鑄。

子宮螺旋動(dòng)脈重鑄過程中血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）消失，由纖維蛋白組織取代，凋亡在這個(gè)過程中不起主要作用，但EVT誘導(dǎo)的VSMCs自血管壁遷移并消失在這個(gè)過程中起主要作用[12]。有研究證明EVT外泌體信號(hào)通過誘導(dǎo)VSMCs的遷移有助于螺旋動(dòng)脈重鑄。侵襲性強(qiáng)的EVT細(xì)胞模型產(chǎn)生的外泌體量多，而且誘導(dǎo)VSMCs遷移的能力強(qiáng)。用超聲波破壞外泌體結(jié)構(gòu)，該作用消失，說明結(jié)構(gòu)完整才能保證外泌體的功能正常[13]。

HLA-G分子屬于非經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ（MHCⅠ）類分子，特異性高表達(dá)于母胎界面的EVT。dNK細(xì)胞是妊娠子宮最主要的免疫細(xì)胞，占70%，能分泌多種細(xì)胞因子，其細(xì)胞毒性低于非妊娠期的子宮內(nèi)膜NK細(xì)胞。HLA-G可與dNK表面的抑制性受體KIR結(jié)合，抑制其對(duì)EVT的殺傷活性，EVT如果減少或缺乏HLA-G表達(dá)將不可避免地被dNK殺傷，引起侵入過淺及螺旋動(dòng)脈管腔狹窄，導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)EVT來源的外泌體HLA-G陽性，具有抑制母體免疫細(xì)胞作用，而且用抗HLA-G的抗體可以檢測(cè)出EVT來源的外泌體，為其分離純化和功能研究提供基礎(chǔ)[14-15]。

2.2.2 胎盤外泌體在母胎界面免疫耐受中的作用 在妊娠期，外泌體在胎盤與母體免疫系統(tǒng)間起作用，參與細(xì)胞間的信息傳導(dǎo)。除了對(duì)dNK細(xì)胞的抑制外，胎盤外泌體還能抑制母體T細(xì)胞信號(hào)，提高母體對(duì)同種半異體胎兒的免疫耐受。這種母胎界面的免疫豁免歸功于胎盤外泌體攜帶的細(xì)胞死亡因子配體（FasL）、程序性死亡配體 1（PD-L1）和 TNF 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL），這些配體能夠誘導(dǎo)母體T細(xì)胞的失活和死亡。而且胎盤外泌體還攜帶NK細(xì)胞表面活化性受體D（NKG2D）的配體、UL-16鏈接蛋白和MHCⅠ相關(guān)蛋白，能降低母體NK細(xì)胞活性，細(xì)胞毒作用減弱，有利于胎兒存活[16]。

2.2.3 胎盤外泌體參與胎盤屏障的形成 抗病毒機(jī)制對(duì)于妊娠是至關(guān)重要的，病毒感染會(huì)導(dǎo)致胎兒生長受限（FGR）、出生缺陷和（或）胎死宮內(nèi)。母胎界面是非常關(guān)鍵的物理和免疫屏障，滋養(yǎng)細(xì)胞是母胎界面的主要組成成分，對(duì)防止病原體傳播至胎兒微環(huán)境起重要作用[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，人原代胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)多種病毒（如巨細(xì)胞病毒）有抗感染能力，而且滋養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液能將抗病毒能力傳遞給非胎盤細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞），說明滋養(yǎng)細(xì)胞將某種抗病毒的物質(zhì)分泌到培養(yǎng)液中，該物質(zhì)就是外泌體，滋養(yǎng)細(xì)胞將特異性的miRNA包裹進(jìn)外泌體，這種miRNA屬于C19MC，具有抗病毒的能力[18]。

3 子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不全相關(guān)妊娠并發(fā)癥中胎盤外泌體的變化

不利于胎盤形成的因素增加妊娠并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致妊娠不良結(jié)局。特別是影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵入和螺旋動(dòng)脈重鑄的因素?fù)p害胎盤功能及胎兒發(fā)育。螺旋動(dòng)脈重鑄不全會(huì)導(dǎo)致妊娠并發(fā)癥，如子癇前期和FGR。

3.1 胎盤外泌體定量的變化子癇前期之所以在妊娠20周后發(fā)生血壓升高等一系列臨床表現(xiàn)，是因?yàn)樽訉m螺旋動(dòng)脈的重鑄是在妊娠20周左右完成的，在螺旋動(dòng)脈重鑄不全基礎(chǔ)上胎盤缺血缺氧，滋養(yǎng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和白細(xì)胞等過量釋放一系列炎性因子和促凝血因子，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，血栓形成，全身過度炎性反應(yīng)引起臨床癥狀[19]。氧是調(diào)節(jié)EVT增殖和分化的主要因素，囊胚植入時(shí)子宮內(nèi)的氧含量為3%，而蛻膜和子宮肌層的氧含量是8%～12%。氧含量的明顯梯度是促進(jìn)EVT重鑄螺旋動(dòng)脈的原因。而氧濃度異常會(huì)影響EVT的功能，EVT外泌體的釋放及外泌體miRNA表達(dá)譜的變化，改變外泌體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生物活性作用。缺氧可能是由滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）異常增多引起的[20]。Salomon等[21]采用納米跟蹤技術(shù)對(duì)正常妊娠和子癇前期患者的血漿總外泌體和胎盤外泌體進(jìn)行定量分析，子癇前期患者的總外泌體和胎盤外泌體含量高于正常妊娠者，且在子癇前期癥狀出現(xiàn)前就開始升高，持續(xù)整個(gè)孕期。低氧誘導(dǎo)胎盤外泌體分泌增加，有研究對(duì)不同氧濃度下培養(yǎng)的EVT細(xì)胞模型（HTR-8/SVneo）分泌的外泌體進(jìn)行納米跟蹤分析發(fā)現(xiàn)，1%氧濃度下該細(xì)胞分泌的外泌體量是8%氧濃度下的3倍，但是該細(xì)胞分泌的外泌體量（CD63+）占總外泌體的比例隨著氧濃度的降低而降低，在8%氧濃度下該比例為（92±5）%，在 1%氧濃度下為（89±6）%，說明在缺氧條件下滋養(yǎng)細(xì)胞囊泡過量釋放，胎盤氧化應(yīng)激，循環(huán)中凋亡體、脫落體等其他囊泡的分泌量的增加多于外泌體量的增加[10]。

還有研究對(duì)早發(fā)型子癇前期與晚發(fā)型子癇前期患者血漿中的胎盤外泌體（PLAP+）與總外泌體（CD63+）進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)早發(fā)型子癇前期發(fā)病時(shí)胎盤外泌體分泌量較相同孕周正常妊娠者高25%～30%，總外泌體量高55%～60%。而晚發(fā)型子癇前期發(fā)病時(shí)胎盤外泌體分泌量較相同孕周正常妊娠者低50%，總外泌體量高45%。無論在早發(fā)型還是晚發(fā)型子癇前期，胎盤外泌體占總外泌體的比例都較正常妊娠降低[22]。

FGR的一個(gè)重要原因是胎盤灌注不足，子癇前期常合并FGR。有研究對(duì)FGR與小于胎齡兒（SGA）母血與胎兒臍血中的總外泌體和胎盤外泌體濃度進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，母血與臍血中的總外泌體在FGR組、SGA組高于正常組，胎盤外泌體在3組間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但FGR組、SGA組胎盤外泌體占總外泌體的比例低于正常組。主要證明了以下幾點(diǎn)：①胎盤來源的外泌體與總外泌體的比值是胎兒生長情況的重要標(biāo)志（與胎兒體質(zhì)量和胎盤質(zhì)量呈正相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），而且該比值可能影響母體的輔助性T細(xì)胞1型/2型（Th1/Th2）免疫狀態(tài)，直接與母體炎性反應(yīng)大小相關(guān)。②FGR組和SGA組該比值減小，而且病情越嚴(yán)重（超聲指數(shù)異常和嚴(yán)重的FGR）該比值就越小。③母體與胎兒血循環(huán)中的該比值呈正相關(guān)，提示兩循環(huán)中均有調(diào)節(jié)外泌體比例的機(jī)制[16]。

3.2 胎盤外泌體內(nèi)容物的變化外泌體選擇性的包裹信號(hào)分子，如蛋白質(zhì)與miRNA，miRNA是小的非編碼RNA片段，約22個(gè)核苷酸長度，通過與mRNA 3′末端連接調(diào)控基因表達(dá)。外泌體能將miRNA傳遞到靶細(xì)胞并影響靶細(xì)胞功能[23]。許多研究發(fā)現(xiàn)了子癇前期患者滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)與miRNA出現(xiàn)異常。

在低氧條件下培養(yǎng)的EVT分泌的外泌體能增加血管內(nèi)皮釋放TNF-α，且外泌體本身也包含TNF-α，并將其轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞中，TNF-α是促凋亡因子，促炎癥因子，導(dǎo)致母體過度炎性反應(yīng)。胎盤蛋白13是滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的蛋白，其生理功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附，利于螺旋動(dòng)脈重鑄。近年研究發(fā)現(xiàn)胎盤蛋白13對(duì)妊娠相關(guān)疾病有預(yù)測(cè)作用。Sammar等[24]研究發(fā)現(xiàn)正常妊娠母體血清外泌體中胎盤蛋白13的含量一般會(huì)緩慢上升，子癇前期孕婦胎盤外泌體中胎盤蛋白13含量明顯降低。

還有研究發(fā)現(xiàn)，低氧能影響EVT外泌體的miRNA表達(dá)譜。在不同氧濃度下，miRNA有獨(dú)特的序列。與8%的氧濃度比較，在1%氧濃度下培養(yǎng)的EVT的外泌體miRNA有10種表達(dá)上調(diào)，分別是miR-339-5p、miR-16-5p、miR-10a-5p、miR-935、miR-197-3p、let-7a-5p、miR-324-5p、miR-15b-3p、miR-100-5p和miR-365-3p，且這些上調(diào)的miRNA大部分是腫瘤抑制因子，參與破壞細(xì)胞遷移與增殖。子癇前期患者的這些上調(diào)的miRNA可能抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和胎盤血管的形成。另有10種miRNA在低氧下表達(dá)下調(diào)，分別是miR-675-5p、miR-1246、miR-293-5p、miR-3178、miR-4792、miR-548o-3p、miR-1273g-3p、miR-762、miR-3182 和miR-523-3p。理論上這些下調(diào)的miRNA應(yīng)該是促腫瘤形成因子，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和子宮螺旋動(dòng)脈的重鑄，如miR-1246和miR-762分別促進(jìn)肺癌和乳腺癌細(xì)胞的增殖與浸潤；但實(shí)際上這些miRNA中有的是腫瘤抑制因子，如肝細(xì)胞癌中的miR-3178和鼻咽癌中的miR-4792等。這個(gè)矛盾現(xiàn)象有待進(jìn)一步研究[11]。

Ding等[25]研究發(fā)現(xiàn)，miR-519d能抑制EVT的遷移，且能使基質(zhì)金屬蛋白酶基因沉默，降低EVT的侵襲性。子癇前期患者的miR-519d表達(dá)上調(diào)[26]。Salomon等[20]總共確定了300種與妊娠有關(guān)的miRNA，其中hsa-miR-486-1-5p和hsa-miR-486-2-5p是子癇前期早期診斷的候選基因。Shen等[27]研究發(fā)現(xiàn)子癇前期患者胎盤外泌體miR-155升高，能夠抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放具有舒張血管作用的內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS），導(dǎo)致血管收縮，血壓升高。

4 胎盤外泌體變化機(jī)制的探討及展望

缺氧導(dǎo)致胎盤外泌體分泌增多，但是有的研究發(fā)現(xiàn)晚發(fā)型子癇前期胎盤外泌體血清含量低于正常妊娠，還有的研究發(fā)現(xiàn)正常、SGA、FGR組胎盤外泌體的血清含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能是由于細(xì)胞缺氧的程度不同其凋亡的比例也不同[28]。由于EVT缺氧程度不同，螺旋動(dòng)脈重鑄不全的程度也不同，如果缺血缺氧的程度不足以導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞釋放的外泌體功能改變（如晚發(fā)型子癇前期），就會(huì)表現(xiàn)為胎盤外泌體含量的減少。如果缺血缺氧嚴(yán)重，導(dǎo)致外泌體內(nèi)容物變化（miRNA及蛋白的改變）以致功能改變，就會(huì)表現(xiàn)為胎盤外泌體含量增加，促進(jìn)妊娠并發(fā)癥的發(fā)生。但在缺氧基礎(chǔ)上，機(jī)體的其他細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等釋放外泌體量會(huì)明顯增加，所以在妊娠并發(fā)癥胎盤外泌體占總外泌體的比例會(huì)下降，病變?cè)絿?yán)重下降就越多，該比例以及特異性的miRNA有望成為預(yù)測(cè)子癇前期和FGR的血清標(biāo)志物。