代謝組學(xué)在顱腦創(chuàng)傷中的應(yīng)用研究進(jìn)展▲

秦雅靜 符 鋒 陳忠彥 孫洪濤 鐘瑞霞 劉 洋

(1 中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)危重癥醫(yī)學(xué)科，天津市 300162，電子郵箱：272140356@qq.com；2 上海市第四人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海市 200081)

【提要】 顱腦創(chuàng)傷是人類(lèi)致殘、致死的主要原因之一。由于受傷機(jī)制和腦組織的復(fù)雜性，顱腦創(chuàng)傷可誘發(fā)廣泛的病理生理學(xué)改變。代謝組學(xué)可提供顱腦創(chuàng)傷患者單一時(shí)間點(diǎn)生理、生化狀態(tài)的“瞬時(shí)快照”。目前，高通量、高靈敏度的代謝組學(xué)分析工具能夠檢測(cè)和定量小濃度的代謝物，使客觀化、精細(xì)化評(píng)估顱腦創(chuàng)傷成為可能。本文就代謝組學(xué)的概況及其在顱腦創(chuàng)傷診療、預(yù)后評(píng)估等方面的研究進(jìn)展做一綜述。

顱腦創(chuàng)傷是由外部機(jī)械力引起的神經(jīng)學(xué)損傷，為人類(lèi)致殘、致死的主要原因之一，遺留的神經(jīng)功能和認(rèn)知障礙給患者及其家庭帶來(lái)巨大影響[1]。調(diào)查研究顯示，全球每年新增5 200萬(wàn)～5 600萬(wàn)輕度顱腦創(chuàng)傷患者和2 200萬(wàn)～3 600萬(wàn)中重度顱腦創(chuàng)傷患者[2]，2017年全球因顱腦創(chuàng)傷造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)為3 620億～4 450億美元，相當(dāng)于全球生產(chǎn)總值的0.5%[2]。目前，臨床評(píng)估和神經(jīng)影像學(xué)是顱腦創(chuàng)傷診斷與預(yù)后評(píng)估的主要手段，但由于顱腦創(chuàng)傷的損傷機(jī)制和臨床癥狀的異質(zhì)性使目前的評(píng)估方法尚不能滿(mǎn)足顱腦創(chuàng)傷患者的個(gè)性化治療，尤其是輕度和中度顱腦創(chuàng)傷患者[3]。代謝物是體內(nèi)所有生物化和病理生理過(guò)程的組成部分，目前的高通量和高靈敏度的分析工具能夠檢測(cè)和定量低濃度的代謝物。因此，以生物液體為樣本的代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)在顱腦創(chuàng)傷診療和預(yù)后評(píng)估方面較單純的臨床癥狀及神經(jīng)影像學(xué)可能更可靠、實(shí)用。本文就代謝組學(xué)及其在顱腦創(chuàng)傷診療及預(yù)后評(píng)估中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 代謝組學(xué)概況

1.1 代謝組學(xué)的基本特征 代謝物組是某一時(shí)刻生物體內(nèi)所有代謝物的集合，其濃度隨宿主對(duì)內(nèi)部或外部刺激后病理生理的變化而變化，反映環(huán)境因素和遺傳因素在宿主表型上的相互作用。代謝組學(xué)是對(duì)小分子代謝物(分子量<1 kD)識(shí)別和量化的整合研究[4]，可分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)。靶向代謝組學(xué)被用于定量數(shù)量有限的已知代謝物，而非靶向方法用于半定量盡可能多的代謝物(包括樣品中已知和未知的代謝物)[5]。血液、唾液、尿液、痰液、支氣管肺泡灌洗液、眼淚、糞便、精液、腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)和呼出氣冷凝物等多種樣品均可用于代謝組學(xué)研究。代謝產(chǎn)物可能是病因特異性的或非特異性的標(biāo)志物，取決于樣品來(lái)源和涉及的生物學(xué)途徑[6]。因此，代謝組學(xué)已經(jīng)改變了“生物標(biāo)志物”的概念，其不僅可量化代謝物，還識(shí)別疾病的代謝模式，即代謝指紋或生物模式[7]。代謝組學(xué)提供了在特定時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞或組織(器官)的分子狀態(tài)的綜合視圖，包括在基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析中未見(jiàn)到的表觀遺傳學(xué)影響。如果在臨床表現(xiàn)出現(xiàn)之前檢測(cè)到代謝改變的信號(hào)，則可能早期診斷和治療某種疾病，從而增加成功治療或治愈的可能性。

1.2 代謝組學(xué)分析平臺(tái) 用于代謝組學(xué)研究的高通量分析平臺(tái)可以分為檢測(cè)技術(shù)和分離技術(shù)或兩者的組合。其中，核磁共振光譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)和質(zhì)譜(mass spectrum，MS)用于檢測(cè)代謝物，氣相色譜(gas chromatography，GC)或液相色譜(liquid chromatography，LC)用于分離代謝物[8]。而GC-MS和LC-MS等聯(lián)用技術(shù)是高靈敏度和準(zhǔn)確度的分析工具，兩者已被廣泛應(yīng)用于鑒定人類(lèi)生物樣品中的數(shù)千種代謝物。

GC-MS可以用于半定量鑒定低濃度的化合物，尤其是揮發(fā)性化合物。衍生化方法可以增加非揮發(fā)性化合物的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性，以便用于GC-MS分析。基于不同分子對(duì)由特殊聚合物制成的固定相親和力的差異，可在氣體加熱柱(氣相色譜)中徹底分離生物樣品中的衍生分子。根據(jù)分子的質(zhì)荷比，質(zhì)譜儀在復(fù)雜的物理化學(xué)過(guò)程中離子化和鑒定每個(gè)分子。分離和檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合可根據(jù)保留時(shí)間和質(zhì)荷比確定化合物，由此成為代謝組學(xué)高分辨率工具[9-10]，如增強(qiáng)型色譜柱、離子源、質(zhì)量分析儀和化合物文庫(kù)等GC-MS領(lǐng)域最新的創(chuàng)新性發(fā)展技術(shù)，提高了鑒定代謝物的靈敏度和特異性。GC-MS可用二維方法(即二維色譜模式)，如串聯(lián)層析(GC/GC-MS)或串聯(lián)質(zhì)譜分析儀(GC-MS/MS)，以增強(qiáng)代謝物的鑒定效果，從而檢測(cè)出在常規(guī)GC-MS中未能被識(shí)別的多種化合物[11]。

LC-MS是一種功能強(qiáng)大、靈敏度高的代謝組學(xué)分析技術(shù)，僅需少量樣品且無(wú)須高溫條件就可檢測(cè)代謝物。該技術(shù)在LC中通過(guò)流動(dòng)相(溶劑)和固定相之間的相互作用將化合物分離，并在質(zhì)譜儀中鑒定分離出的化合物。LC-MS是一種極其敏感的代謝組學(xué)方法，能夠檢測(cè)小于1 pg的分子[12]，其是識(shí)別非極性、非揮發(fā)性、半極性化合物和熱不穩(wěn)定化合物的可靠技術(shù)[13-14]。目前高壓GC-MS、超高壓GC-MS和親水相互作用LC-MS均已被用于代謝組學(xué)的研究。

2 代謝組學(xué)在顱腦創(chuàng)傷中的應(yīng)用前景

異質(zhì)性是影響顱腦創(chuàng)傷診斷和預(yù)后的主要難題，格拉斯哥昏迷量表(Glasgow Coma Scale，GCS)評(píng)分、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙持續(xù)時(shí)間、傷后天數(shù)、多發(fā)傷以及頭部損傷次數(shù)均是影響顱腦創(chuàng)傷異質(zhì)性的重要因素。目前的影像技術(shù)和臨床評(píng)估方法評(píng)估神經(jīng)損傷的敏感性低，而使用單一代謝物作為診斷生物標(biāo)志物的研究并不可行[15]。代謝組學(xué)可以通過(guò)代謝譜對(duì)患者進(jìn)行聚類(lèi)來(lái)降低診斷顱腦創(chuàng)傷的異質(zhì)性，其有望成為精確診斷顱腦創(chuàng)傷的技術(shù)，尤其是適用于輕度顱腦創(chuàng)傷[16]。

顱腦創(chuàng)傷的預(yù)后評(píng)估也是神經(jīng)科醫(yī)師面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)，年齡、性別和遺傳因素等因素均可能影響患者的病程和預(yù)后。通過(guò)測(cè)定新型代謝生物標(biāo)志物的變化以區(qū)分顱腦創(chuàng)傷的各個(gè)階段，有助于評(píng)估患者的預(yù)后[17]?；诖x組學(xué)技術(shù)分析出的小分子代謝物可用于準(zhǔn)確識(shí)別易發(fā)生后遺癥的患者，進(jìn)而有助于針對(duì)個(gè)體進(jìn)行特殊康復(fù)治療。

代謝產(chǎn)物可作為鑒別局灶性和彌漫性顱腦損傷、原發(fā)性和繼發(fā)性顱腦損傷的生物標(biāo)志物[18]。由于代謝物的濃度和類(lèi)型可能會(huì)隨著受損區(qū)域的變化而變化，因此代謝組學(xué)可以用于定量評(píng)估顱腦損傷，如神經(jīng)元特異性烯醇化酶、S100β和血影蛋白分解產(chǎn)物等蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的濃度在局灶性與彌漫性顱腦損傷患者中存在差異[18]。此外，在目前缺乏敏感的神經(jīng)影像學(xué)技術(shù)用于識(shí)別特定解剖學(xué)損傷的情況下，基于顱腦創(chuàng)傷的損傷解剖位置呈特異性改變的代謝物檢測(cè)可更好地對(duì)患者進(jìn)行分類(lèi)并預(yù)測(cè)結(jié)局。研究表明，對(duì)于重復(fù)性顱腦創(chuàng)傷，代謝組學(xué)可能有助于識(shí)別具有高復(fù)發(fā)性腦震蕩風(fēng)險(xiǎn)的運(yùn)動(dòng)員，或更準(zhǔn)確地評(píng)估復(fù)蘇進(jìn)展；連續(xù)采樣及監(jiān)測(cè)生物標(biāo)志物可以闡明患者的情況、確認(rèn)重復(fù)性顱腦創(chuàng)傷引起的累積效應(yīng)、識(shí)別與執(zhí)行功能缺陷相關(guān)的模式，以防止腦震蕩的反復(fù)發(fā)作[19]。

3 代謝物-生物標(biāo)志物在顱腦創(chuàng)傷中應(yīng)用的研究進(jìn)展

3.1 代謝物-生物標(biāo)志物有助于探索顱腦創(chuàng)傷病理生理學(xué)機(jī)制 了解顱腦創(chuàng)傷相關(guān)代謝物的變化可以揭示顱腦創(chuàng)傷病理生理級(jí)聯(lián)信息，從而探索潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。顱腦創(chuàng)傷患者CSF和血液中的代謝物濃度常常不同，CSF中的代謝物可用于評(píng)估顱腦創(chuàng)傷患者血腦屏障的功能性。代謝物分析可以用于闡明顱腦創(chuàng)傷繼發(fā)性損傷所涉及的細(xì)胞和分子機(jī)制[20]，基于代謝組學(xué)的研究有助于預(yù)防或減少顱腦創(chuàng)傷繼發(fā)性損傷。

谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸是大腦內(nèi)的主要神經(jīng)遞質(zhì)。谷氨酸是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，可激活N-甲基-D-天冬氨酸受體，從而介導(dǎo)廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[21]。顱腦創(chuàng)傷發(fā)生后由于神經(jīng)功能障礙和細(xì)胞死亡，腦代謝明顯增加，易因缺氧、低血壓和癲癇發(fā)作而造成顱腦繼發(fā)性損傷；糖酵解使血清乳酸水平增加，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙并損害血腦屏障，最終導(dǎo)致腦水腫[22]。代謝物-生物標(biāo)志物可反映顱腦創(chuàng)傷后功能性腦損傷、繼發(fā)性腦損傷和神經(jīng)代謝級(jí)聯(lián)的時(shí)間過(guò)程，包括評(píng)估膜結(jié)構(gòu)響應(yīng)代謝、ATP依賴(lài)性離子泵、細(xì)胞能量代謝和腦血流量。高通量分析工具能夠識(shí)別與代謝變化、離子和微絲化合物改變相關(guān)的軸突損傷代謝物，如監(jiān)測(cè)到過(guò)量的興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)(如谷氨酸、磷脂酰絲氨酸等)，則提示細(xì)胞凋亡的開(kāi)始[23]。

3.2 代謝組學(xué)在顱腦創(chuàng)傷動(dòng)物模型中的應(yīng)用 動(dòng)物模型已被用于研究顱腦創(chuàng)傷，并已發(fā)現(xiàn)基于代謝組學(xué)的新型生物標(biāo)志物。例如，CSF中溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)水平的升高反映其在顱腦創(chuàng)傷研究領(lǐng)域的潛在作用：LPA可增強(qiáng)血腦屏障的通透性進(jìn)而導(dǎo)致腦水腫和出血，并可以誘導(dǎo)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6等炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[24]；LPA抗體可降低LPA對(duì)腦的神經(jīng)毒性和促炎癥作用，改善顱腦創(chuàng)傷小鼠的神經(jīng)功能[24]。Abdullah等[25]采用基于LC-MS的代謝組學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)小鼠顱腦創(chuàng)傷后3個(gè)月，海馬體中卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)均增加，而在皮質(zhì)與小腦處減少；大腦皮層的卵磷脂及PE水平均高于小腦。卵磷脂、鞘磷脂及PE在顱腦創(chuàng)傷小鼠的不同腦葉中都具有其各自的區(qū)域特異性變化模式。

3.3 代謝組學(xué)在顱腦創(chuàng)傷患者中的應(yīng)用 N-乙酰天冬氨酸(N-acetylaspartate，NAA)和乳酸鹽可能是預(yù)測(cè)顱腦創(chuàng)傷患者短期臨床結(jié)局的潛在生物標(biāo)志物[26]。Barkhoudarian等[27]通過(guò)磁共振波譜分析技術(shù)探索中重度顱腦創(chuàng)傷后患者大腦代謝變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，血清NAA/蛋氨酸比值與GCS評(píng)分呈正相關(guān)，與傷后3個(gè)月格拉斯哥預(yù)后量表(Glasgow Outcome Scale，GOS)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)；血清乳酸/蛋氨酸比值與GCS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與傷后3個(gè)月GOS評(píng)分呈正相關(guān)。乳酸是顱腦創(chuàng)傷后早期反映神經(jīng)軸索損傷的生物標(biāo)志物，可用于顱腦創(chuàng)傷嚴(yán)重程度和結(jié)局的預(yù)測(cè)；而NAA為神經(jīng)元滲透代謝物、脂質(zhì)和髓磷脂生物合成的前體，其并非顱腦創(chuàng)傷特異性生物標(biāo)志物，肌萎縮側(cè)索硬化癥、多發(fā)性硬化癥和血管性癡呆亦會(huì)引起NAA升高[28]。有學(xué)者采用磁共振氫譜技術(shù)檢測(cè)顱腦創(chuàng)傷患者的CSF，發(fā)現(xiàn)其乳酸、丙二醇、谷氨酰胺及肌酐水平明顯升高，而丙二醇與腦水腫密切相關(guān)，乳酸和丙二醇是氧代謝率、顱內(nèi)壓和GOS評(píng)分的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子[29]。

代謝物-生物標(biāo)志物檢測(cè)亦有助于顱腦創(chuàng)傷嚴(yán)重程度分類(lèi)。Jeter等[30]使用GC-MS和LC-MS比較健康者和顱腦創(chuàng)傷患者的血漿代謝物，結(jié)果顯示，與健康者相比，重度顱腦創(chuàng)傷患者的血漿主要代謝產(chǎn)物如纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和特異性代謝產(chǎn)物異丁酰肉堿、3-甲基-2-氧代戊酸、丙酰肉堿和異戊酰肉堿水平均明顯降低，甲基戊二酰肉堿水平也降低；與健康者相比，輕度顱腦創(chuàng)傷患者血漿纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸水平降低，而丙酰肉堿水平增加。這提示支鏈氨基酸代謝的改變可能影響顱腦創(chuàng)傷患者的能量代謝、蛋白質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)合成。Jeter等[30]還發(fā)現(xiàn)，異亮氨酸和亮氨酸與顱內(nèi)壓升高(≥25 mmHg)密切相關(guān)，丙酸肉堿、2-甲基丁酰肉堿、4-甲基-2-氧代戊酸酯是顱內(nèi)壓升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因子；而其采用非靶向LC-MS分析尿液代謝組學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)有3 897項(xiàng)代謝指標(biāo)有助于重度顱腦創(chuàng)傷的診斷。

Ottens等[31]應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜揭示了急性康復(fù)期后重度顱腦創(chuàng)傷患者的神經(jīng)發(fā)育反應(yīng)和康復(fù)進(jìn)展的生物學(xué)機(jī)制。該研究提示基于尿液的代謝組學(xué)是一種無(wú)創(chuàng)、有效的連續(xù)采樣縱向監(jiān)測(cè)方式，對(duì)顱腦創(chuàng)傷分類(lèi)具有潛在作用。Yi等[32]采用GC-MS技術(shù)對(duì)血清代謝物水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)中重度顱腦創(chuàng)傷患者與健康對(duì)照組血清中有20種代謝變化差異，其中存在認(rèn)知障礙的中重度顱腦創(chuàng)傷患者血清絲氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺及花生四烯酸水平較健康對(duì)照組增加，丙酮酸、丙氨酸、谷氨酰胺水平較健康對(duì)照組降低(P<0.05)；無(wú)認(rèn)知障礙的中重度顱腦創(chuàng)傷患者血清絲氨酸、苯丙氨酸、花生四烯酸和半乳糖水平較存在認(rèn)知障礙的患者顯著降低(P<0.05)。這說(shuō)明顱腦創(chuàng)傷后的認(rèn)知障礙與氨基酸代謝異常及脂質(zhì)代謝改變有關(guān)，基于GC-MS技術(shù)的血清代謝物檢測(cè)或可用于鑒別顱腦創(chuàng)傷后有無(wú)認(rèn)知功能障礙。但上述研究納入病例數(shù)較少，今后仍需大樣本多中心研究予以驗(yàn)證。

3.4 挑戰(zhàn)和技術(shù)限制 多發(fā)傷所致多種生物標(biāo)志物升高可能顯著降低顱腦創(chuàng)傷相關(guān)代謝物-生物標(biāo)志物的特異性。理想的顱腦創(chuàng)傷相關(guān)代謝物-生物標(biāo)志物應(yīng)具有高敏感性、高特異性和高準(zhǔn)確性，且具有低假陽(yáng)性和低假陰性[33]，還不應(yīng)受到如性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)和種族等因素的影響[34]，其應(yīng)在顱腦創(chuàng)傷后迅速分泌至血液或高表達(dá)，可評(píng)估損傷程度、反映病理生理學(xué)狀況并具有預(yù)后評(píng)估作用[35]。目前有關(guān)顱腦創(chuàng)傷相關(guān)代謝物-生物標(biāo)志物的研究較少，仍需對(duì)代謝組學(xué)研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證以提高其可重現(xiàn)性和可預(yù)測(cè)性。小樣本量是低效研究的主要問(wèn)題，通常出現(xiàn)低強(qiáng)度分析和過(guò)度擬合。小樣本量與患者異質(zhì)性的相結(jié)合可導(dǎo)致數(shù)據(jù)誤解、預(yù)測(cè)能力降低和代謝標(biāo)志物的選擇不正確，因此錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率可能會(huì)增加[36]。因此，使用代謝變化的效應(yīng)大小進(jìn)行功效分析對(duì)估計(jì)樣本量至關(guān)重要。此外，最常見(jiàn)的代謝組學(xué)分析手段如GC-MS、LC-MS均受基質(zhì)效應(yīng)、離子抑制和衍生化誤差的影響，這些均是代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的潛在威脅。代謝變化對(duì)混雜因素(年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、腸道微生物)和生活方式也非常敏感[37]。由于代謝物濃度將隨時(shí)間變化，故采樣時(shí)間對(duì)代謝組學(xué)分析影響也很大，因此要使用標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行采樣，以隨機(jī)方式設(shè)置樣品進(jìn)行單次分析，以避免批次導(dǎo)致的影響。

4 總結(jié)與展望

顱腦創(chuàng)傷為高度異質(zhì)性疾病，目前尚無(wú)高靈敏度和特異性的單一生物標(biāo)志物用于顱腦創(chuàng)傷的診斷或預(yù)后評(píng)估。筆者認(rèn)為代謝組學(xué)有以下的優(yōu)勢(shì)：可發(fā)現(xiàn)用于顱腦創(chuàng)傷患者診斷和預(yù)后評(píng)估的代謝物-生物標(biāo)志物，這有助于揭示顱腦創(chuàng)傷潛在的病理生理學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制；高通量分析工具能夠識(shí)別和量化數(shù)百種代謝物；此外，由于代謝物比蛋白質(zhì)、RNA及基因更不容易被剪切，因此代謝組學(xué)也可能比基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)更省時(shí)省力。隨著個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展，代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物可促進(jìn)患者個(gè)性化治療的發(fā)展，并有助于通過(guò)藥物代謝組學(xué)方法選擇最佳的治療策略。