藥物性肝損傷體外檢測平臺的研究進(jìn)展

藥物性肝損傷(DILI)是指由各類處方或非處方的化學(xué)藥物、生物制劑、傳統(tǒng)中藥、天然藥物、保健品、膳食補(bǔ)充劑及其代謝產(chǎn)物乃至輔料等所誘發(fā)的肝損傷。在中國成年人中，有10%～50%的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高是由藥物引起的。DILI也是導(dǎo)致藥物研發(fā)終止和撤藥的常見原因。DILI根據(jù)發(fā)病機(jī)制分為固有型DILI(InDILI)和特異質(zhì)型DILI(IDILI)兩種，前者是可預(yù)測的，個體差異不顯著，而后者與個體對DILI的敏感度有關(guān)，個體差異顯著，是不可預(yù)測的。如何在藥物上市前預(yù)測該藥的肝毒性，如何在個體用藥前評估其發(fā)生IDILI的風(fēng)險，從而指導(dǎo)個體精準(zhǔn)用藥，是目前關(guān)于DILI的研究熱點(diǎn)。本文結(jié)合藥物在肝臟內(nèi)的代謝過程，就IDILI體外檢測平臺的研究進(jìn)展作一綜述。

1 藥物在肝臟內(nèi)的代謝過程及IDILI的發(fā)病機(jī)制

1.1 第Ⅰ相反應(yīng)

在肝細(xì)胞內(nèi)，非極性藥物在Ⅰ相藥物代謝酶(ⅠDME)的作用下，通過氧化、還原和水解等反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為活性形式發(fā)揮作用。ⅠDME屬于細(xì)胞色素P450(CYP450)氧化酶家族。CYP450對藥物的代謝具有雙向性，主要代謝途徑是對藥物原型進(jìn)行滅活或脫毒，而次要代謝途徑則可能使原型化合物進(jìn)行致毒或致癌活化等。由于CYP450存在基因多態(tài)性，部分個體在代謝過程中會積蓄有毒或致癌物質(zhì)，造成肝損傷；或原本沒有抗原性的藥物經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化成具有抗原性的代謝產(chǎn)物，引起免疫性肝損傷。有研究報道，來氟米特介導(dǎo)的肝毒性與CYP2C9*3基因型相關(guān)[1]。

1.2 第Ⅱ相反應(yīng)

肝細(xì)胞內(nèi)，藥物分子的極性基團(tuán)(大部分是經(jīng)ⅠDME代謝產(chǎn)生的)在Ⅱ相藥物代謝酶(ⅡDME)的作用下，與內(nèi)源性化合物經(jīng)共價鍵結(jié)合，生成極性大、水溶性高的化合物，經(jīng)膽汁排泄。部分藥物通過ⅡDME解毒，如果ⅡDME基因突變，ⅡDME的活性下降，將會導(dǎo)致IDILI。葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)是體內(nèi)催化葡萄糖醛酸與底物結(jié)合的重要的ⅡDME。UGT1A1基因啟動子TATA盒區(qū)域TA重復(fù)序列的基因多態(tài)性，導(dǎo)致隨著TA重復(fù)序列的增加，酶的表達(dá)及活性下降，影響相關(guān)藥物的代謝，其中典型的是尼洛替尼。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用尼洛替尼治療的患者中，含7個TA重復(fù)序列的純合子TA(7)TA(7)(即UGT1A1*28)基因型發(fā)生高膽紅素血癥的概率明顯高于含6個TA重復(fù)序列的純合子TA(6)TA(6)基因型和雜合子TA(6)TA(7)基因型，提示臨床上對于UGT1A1*28等位基因患者應(yīng)慎用尼洛替尼，防止出現(xiàn)高膽紅素血癥[2]。

1.3 第Ⅲ相反應(yīng)

藥物或代謝產(chǎn)物經(jīng)由藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體排至膽汁或血液循環(huán)中。藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體位于肝細(xì)胞頂端或肝小管膜上，藥物經(jīng)由它的轉(zhuǎn)運(yùn)出入肝細(xì)胞。轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的基因變異可導(dǎo)致肝臟疾病，其功能障礙還會引起藥物在體內(nèi)蓄積，這也是IDILI的發(fā)生機(jī)制之一。檢測這些藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性對于預(yù)測個體對藥物的易感性具有重大意義。

1.4 脂質(zhì)過氧化損傷

肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷是IDILI的重要發(fā)病機(jī)制之一。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧能造成肝細(xì)胞損傷。細(xì)胞線粒體中存在多種抗氧化酶，能拮抗活性氧引起的脂質(zhì)過氧化損傷，比如超氧化物歧化酶2，其基因變異可增加肝臟對抗結(jié)核藥物的易感性，導(dǎo)致藥物在肝臟內(nèi)蓄積，引起肝內(nèi)膽汁淤積[3]。

1.5 免疫反應(yīng)

第Ⅰ相反應(yīng)生成的中間代謝產(chǎn)物作為半抗原，能被肝內(nèi)淋巴細(xì)胞識別，啟動針對該半抗原及肝細(xì)胞的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致急性肝損傷和藥物誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎。另外，肝內(nèi)吞噬細(xì)胞能吞噬壞死或凋亡的肝細(xì)胞，將其作為抗原遞呈給主要組織相溶性復(fù)合體(MHC)，后者再通過T淋巴細(xì)胞啟動免疫反應(yīng)，釋放多種細(xì)胞因子，包括炎性細(xì)胞因子[如γ-干擾素(γ-IFN)、白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)等]，以及具有抗炎作用的細(xì)胞因子(如IL-4、IL-10等)，當(dāng)兩種細(xì)胞因子作用失衡，就會導(dǎo)致DILI。在對乙酰氨基酚引起的DILI中，IL-1α和γ-IFN的表達(dá)水平升高；IL-4和IL-10的基因突變能使雙氯芬酸誘導(dǎo)的DILI風(fēng)險升高[4]。MHC由人類白細(xì)胞抗原(HLA)基因編碼，HLA是目前已知的人類染色體中基因密度最高、多態(tài)性最為豐富的區(qū)域，在不同的種族或同一種族不同群體中的分布有明顯的種群特征，從而導(dǎo)致個體對藥物的反應(yīng)不一，這也是IDILI的發(fā)病機(jī)制之一。

2 IDILI的體外檢測平臺

近年來，有關(guān)IDILI體外檢測平臺的研究取得了較大進(jìn)展。這對于IDILI的診斷、藥物上市前的肝毒性預(yù)測和評估有較大意義，下文將從基因水平、細(xì)胞水平和組織水平分別對各檢測平臺作一介紹。

2.1 基因水平的IDILI檢測平臺

全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)揭示了HLA基因多態(tài)性與IDILI的相關(guān)性，證實(shí)了由于風(fēng)險等位基因的存在，使個體有更高的患IDILI風(fēng)險，對于指導(dǎo)個體化用藥有重大意義。

阿巴卡韋(abacavir)是治療艾滋病的藥物，接受該藥治療的患者中約有4%發(fā)生過敏反應(yīng)，部分過敏反應(yīng)是致死性的，GWAS已經(jīng)證實(shí)HLA-B*5701等位基因與患者對阿巴卡韋的高敏反應(yīng)有關(guān)，美國食品和藥品管理局(FDA)推薦應(yīng)在進(jìn)行阿巴卡韋治療前檢測HLA-B*5701等位基因情況，相關(guān)的試劑盒已經(jīng)商品化，這是將藥物遺傳學(xué)應(yīng)用于指導(dǎo)藥物臨床應(yīng)用的成功案例[5]。氟氯西林是一種半合成青霉素，該藥可導(dǎo)致膽汁淤積型DILI。研究表明，有HLA-B*57∶01等位基因的患者應(yīng)用該藥時，發(fā)生DILI的概率是沒有該等位基因的患者的81倍。盡管研究結(jié)論令人鼓舞，但是氟氯西林所致肝損傷的發(fā)生率僅8.5/100 000，使得該等位基因檢測試劑盒的臨床應(yīng)用價值有限[6-7]。米諾環(huán)素是一種半合成的四環(huán)素，基于白種人的研究表明HLA-B*35∶02等位基因與米諾環(huán)素引起的肝損傷密切相關(guān)[8]，但由于米諾環(huán)素引起的DILI發(fā)病率較低，且HLA-B*35∶02等位基因陽性率在白種人中僅為0.3%，在非裔美國人中甚至僅為0.1%，使得該等位基因預(yù)測米諾環(huán)素引起的DILI的價值不高，但是可用于鑒別米諾環(huán)素引起的DILI與自身免疫性肝炎[9]。

2.2 細(xì)胞水平的IDILI檢測平臺

2.2.1 單細(xì)胞平臺 目前原代人類肝細(xì)胞被認(rèn)為是預(yù)測DILI最好的單細(xì)胞模型。但該細(xì)胞來源不易，制備成本高，且在體外培養(yǎng)中會迅速失去關(guān)鍵功能，使其應(yīng)用受限[10-11]。利用能表達(dá)藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和氧化/抗氧化酶的永生化細(xì)胞系模擬肝臟細(xì)胞，進(jìn)行藥物代謝研究，具有成本低、可調(diào)控和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。其中常用的是THLE細(xì)胞，它是利用SV40大T抗原轉(zhuǎn)化使上皮細(xì)胞永生化形成的細(xì)胞系。該細(xì)胞系中DME的表達(dá)量較低，研究者可以利用轉(zhuǎn)基因方法使其表達(dá)特定組合的DME，觀察藥物的代謝情況，并制成劑量-效應(yīng)曲線[12]。Leite等[13]使用CYP450轉(zhuǎn)基因的THLE細(xì)胞成功評估了多種藥物的DILI風(fēng)險。HepaRG細(xì)胞是來源于人肝前體細(xì)胞系的終末分化肝細(xì)胞，保留了多種原代肝細(xì)胞的特征，包括DME、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白體、核受體的表達(dá)等[14]。Mueller等[15]發(fā)現(xiàn)HepaRG細(xì)胞在懸浮的液滴狀態(tài)下具有三維生長潛能，且其中DME關(guān)鍵酶的表達(dá)遠(yuǎn)大于單層細(xì)胞狀態(tài)。

Benesic等[16]開發(fā)了MetaHeps系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用來源于受試者外周血的單核細(xì)胞衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞(MH細(xì)胞)對藥物進(jìn)行肝毒性檢測。由于該MH細(xì)胞具有受試者的個體特征，故MetaHeps系統(tǒng)適用于IDILI的檢測，并可用于研究藥物之間的相互作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，MetaHeps系統(tǒng)診斷多藥共用狀態(tài)下IDILI的敏感度和特異度均高于臨床上常用的RUCAM診斷量表；對31例IDILI患者(實(shí)驗(yàn)組)和23例非DILI患者(對照組)的MH細(xì)胞進(jìn)行可疑藥物的肝毒性檢測，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組有29例檢測到了藥物肝毒性，而對照組中無1例出現(xiàn)肝毒性，表明MetaHeps系統(tǒng)診斷和預(yù)測IDILI的敏感度和特異度都較高；1例IDILI患者同期服用84種藥物，利用該患者的MH細(xì)胞對84種可疑藥物進(jìn)行檢測，僅4種藥物呈陽性表達(dá)，表明MetaHeps系統(tǒng)有助于明確多藥共用IDILI患者的致病藥物[18]。中國已進(jìn)入老齡化社會，老年人常罹患多種疾病，需同時服用多種藥物，而大部分藥物通過肝臟代謝，在老年人多藥共用狀態(tài)下如何預(yù)防及診斷IDILI是臨床醫(yī)生面臨的棘手問題，MetaHeps系統(tǒng)無疑可作為一項(xiàng)實(shí)用的方法。

利用干細(xì)胞技術(shù)制備的人類細(xì)胞篩查腺瘤檢出率是預(yù)測IDILI的一種有前景的方法。隨著可誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)問世，使利用個體的iPSC進(jìn)行IDILI預(yù)測成為可能。干細(xì)胞具有多向分化潛能，如何使個體的iPSC分化為所需要的肝臟細(xì)胞是首先需要解決的問題。iPSC可以分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞(HLC)，Szkolnicka等[19]的研究表明分化的iPSC能表達(dá)CYP1A和CYP3A，并與體外培養(yǎng)的凍存肝細(xì)胞表現(xiàn)出相似的藥物應(yīng)答。但是，HLC目前還無法具有完全成熟的肝細(xì)胞表型[20]。

IDILI的復(fù)雜性意味著目前沒有任何一種單細(xì)胞模型能夠充分模擬DILI的全過程，不論這種細(xì)胞是原代人肝細(xì)胞、肝細(xì)胞系還是來源于干細(xì)胞。盡管如此，模擬肝細(xì)胞主要特征的單細(xì)胞模型在評估潛在的肝損傷風(fēng)險方面還是具有價值的，對于建立復(fù)雜的多細(xì)胞肝臟模型也是至關(guān)重要的。

2.2.2 肝臟細(xì)胞的共培養(yǎng)體系 肝組織中除了肝細(xì)胞，還有膽管細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和多種免疫活性細(xì)胞。Kostadinova等[21]應(yīng)用多孔層狀尼龍支架培養(yǎng)肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，制成共培養(yǎng)體系，該體系內(nèi)的細(xì)胞能夠沿著尼龍支架生長成三維結(jié)構(gòu)，具有正常肝組織的功能，并能維持11周，通過向支架中加入脂多糖能誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子。此研究利用該體系成功檢測了CYP450活性和肝細(xì)胞對藥物的攝取。另有研究者利用成纖維細(xì)胞和肝細(xì)胞共培養(yǎng)來模擬肝臟的微環(huán)境，但由于該體系內(nèi)細(xì)胞是單層培養(yǎng)，而且僅有兩種細(xì)胞，缺乏多樣性，不能反映真實(shí)的肝組織環(huán)境，在檢測藥物肝毒性過程中出現(xiàn)的假陰性較多[22]。有研究者用基質(zhì)細(xì)胞代替該體系中的成纖維細(xì)胞，結(jié)果也不容樂觀[23]。Rose等[24]將肝細(xì)胞和庫普弗細(xì)胞置于24孔膠原涂層板內(nèi)共培養(yǎng)，成功模擬了肝臟的炎性反應(yīng)。利用該共培養(yǎng)體系可以對CYP450的活性和免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測。Chen等[25]報道利用原代人肝細(xì)胞構(gòu)建的多細(xì)胞共培養(yǎng)體系對19種已經(jīng)被FDA證實(shí)的肝毒性藥物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其預(yù)測藥物肝毒性的敏感度達(dá)100%。

隨著微流體技術(shù)、生物打印技術(shù)和組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者已經(jīng)不滿足于僅將肝細(xì)胞和肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)的二維共培養(yǎng)體系。肝組織缺血缺氧會影響肝細(xì)胞功能，為了模擬血供對肝細(xì)胞代謝能力的影響，自2010年以來，多個研究團(tuán)隊(duì)對包含肝細(xì)胞和肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的微流體共培養(yǎng)裝置進(jìn)行了研究，在這個裝置中，培養(yǎng)肝臟細(xì)胞的微環(huán)境是液態(tài)的，而且它的氧供和流動性等參數(shù)是可調(diào)節(jié)的。研究者發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞和肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞在微流體共培養(yǎng)體系中生長，肝細(xì)胞的I DME活性明顯高于靜態(tài)的共培養(yǎng)體系以及不含非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的微流體培養(yǎng)體系。另外，該共培養(yǎng)體系能成功形成膽小管，并可以檢測轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，它的缺點(diǎn)在于不能進(jìn)行高通量的藥物篩選，目前只用于實(shí)驗(yàn)室研究[26-27]。據(jù)報道，利用組織工程技術(shù)和新型生物材料構(gòu)筑球形基質(zhì)，將肝臟細(xì)胞置于其中的微小通道內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，模擬肝臟的三維結(jié)構(gòu)和功能，能模擬肝臟脂肪變性和膽汁淤積[28]，已有學(xué)者將其用于DILI的研究[20]。有研究者利用組織工程技術(shù)制備半乳糖基纖維海綿，將人多能干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞樣細(xì)胞(hPSCHLC)用于對乙酰氨基酚、曲格列酮和氨甲喋呤的肝毒性檢測，發(fā)現(xiàn)其敏感度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的hPSCHLC。

非阿尿苷是禮來公司開發(fā)的治療乙型肝炎的抗病毒藥物，在動物實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的肝毒性不良反應(yīng)，但是在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，15例服用該藥的患者中有7例出現(xiàn)肝衰竭，其中5例死亡，該藥的臨床試驗(yàn)于1994年停止。2011年，Krzyzewski等[29]利用原代人肝細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建微模態(tài)共培養(yǎng)體系，成功檢測出非阿尿苷的肝毒性，提示利用多細(xì)胞共培養(yǎng)體系預(yù)測DILI具有光明前景。此共培養(yǎng)體系由于構(gòu)建復(fù)雜，導(dǎo)致成本較高。

2.3 組織水平的IDILI檢測平臺

利用體外培養(yǎng)的精密肝組織切片進(jìn)行DILI研究，更接近真實(shí)的肝臟微環(huán)境，能反映肝組織內(nèi)不同細(xì)胞間相互作用和肝組織對藥物的整體代謝過程，相對于多種細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，其優(yōu)點(diǎn)顯而易見。Hadi等[30-31]將鼠和人的肝組織切片進(jìn)行體外培養(yǎng)，成功構(gòu)建了肝臟炎性損傷模型，已應(yīng)用于DILI、脂肪肝、肝纖維化的研究中。該系統(tǒng)的缺點(diǎn)在于獲得肝組織切片的過程是有創(chuàng)的，而且組織切片中肝細(xì)胞的代謝能力顯著下降，研究者認(rèn)為肝細(xì)胞代謝能力的下降與切片處于靜態(tài)的培養(yǎng)體系有關(guān)，于是將肝組織切片置于微流體培養(yǎng)裝置中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞功能得到了良好的維持[32]。

為了更好地模擬肝細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境，有研究者將原代人肝細(xì)胞原位種植或者異位種植在嚙齒類動物體內(nèi)，用于DILI的檢測。TK-NOG小鼠能耐受高劑量的非阿尿苷，但原位種植在該小鼠肝臟上的原代人肝細(xì)胞表現(xiàn)出與非阿尿苷用藥劑量相關(guān)的肝毒性[33]。此檢測方法不適用于檢測由于免疫機(jī)制引起的DILI。

3 總結(jié)和展望

IDILI具有不可預(yù)測的特點(diǎn)，其診斷難度較大。DILI體外檢測平臺對于DILI，特別是IDILI的臨床診治、個體化用藥指導(dǎo)和藥物研發(fā)具有重要意義。雖然已有針對發(fā)病機(jī)制單個環(huán)節(jié)開發(fā)的高通量檢測試劑可用于IDILI的預(yù)測，但能夠同時模擬藥物肝臟代謝的整個過程，并具有參數(shù)可調(diào)控的多細(xì)胞或組織平臺對于IDILI的預(yù)測無疑更有特異性，這是未來的研究方向。