兔VX2肝癌移植瘤模型的建立及其影像學評估*

鄧丹 邱世香, 趙茂林 蒲嘉騏 鐘立明

(1.南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院介入科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學院醫(yī)學影像學院，四川 南充 637000)

根據(jù)WHO公布的最新數(shù)據(jù)，全球肝癌2020年新發(fā)病例數(shù)達到91 萬人，新增死亡病例數(shù)約83萬人；在中國肝癌是僅次于肺癌的第二大致死性腫瘤[1]。肝癌具有惡性程度高、病情進展快等特點，臨床仍是以手術切除為主，輔以放化療、靶向藥物治療及介入治療的多學科綜合治療。經(jīng)導動脈灌注化療栓塞(Transcatheter arterial chemoembolization,TACE)是肝癌非手術治療最常用的治療手段[2-3]。近年來關于介入治療肝癌的研究也逐漸增多，大部分是前臨床研究，在這些前臨床研究中，動物腫瘤模型是實驗研究的重要一環(huán)。兔VX2肝癌模型是目前肝癌研究中最常見的腫瘤模型，被廣泛應用于腫瘤影像學、治療效果評估等方面。兔VX2肝癌模型的建立有多種方法，但是各種方法的成瘤率略有差異。本文擬用開腹種植腫瘤組織塊的方法建立兔VX2肝癌模型，運用增強CT掃描及血管造影的方法評估腫瘤的影像學表現(xiàn)，結合本課題組的經(jīng)驗及文獻復習，探討CT及血管造影在VX2肝癌移植瘤診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及VX2荷瘤兔 新西蘭大白兔40只，雄性，體重平均約2.5～3.5 kg，由川北醫(yī)學院動物實驗中心提供及飼養(yǎng)；VX2荷瘤兔2只，雄性，體重分別為2.8 kg和3.4 kg，購自華中科技大學動物實驗中心。本實驗動物處理符合動物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.2 VX2腫瘤的傳代 動物活體傳代是VX2腫瘤的一種保存方法，將VX2腫瘤組織塊或細胞懸浮液種植在實驗兔大腿肌肉。根據(jù)本課題組的經(jīng)驗，接種腫瘤組織塊的成瘤率較高、成瘤速度快。具體方法如下：剝離腫瘤組織并用無菌生理鹽水清洗干凈，選取邊緣生長旺盛的、魚肉樣的組織，用眼科剪剪碎成1～2 mm3大小的瘤塊并將其接種到受體兔的后大腿肌肉內(nèi)，2～3周即可成瘤。見圖1。

圖1 VX2腫瘤的傳代(后大腿肌肉內(nèi)種植)

1.3 兔VX2肝癌模型的建立 40只新西蘭大白兔經(jīng)耳緣靜脈注射20 mg/mL的戊巴比妥鈉4～5 mL,麻醉滿意后固定于自制簡易手術臺上。劍突下備皮，常規(guī)消毒鋪巾。沿劍突下切開皮膚3～4 cm，沿腹白線做正中切口，暴露肝左葉。用血管鉗在臟面做深約1 cm的竇道，然后置入1～2粒腫瘤組織塊，用明膠海綿條封閉竇道防止腫瘤的播散及止血。將肝左葉回納至腹腔，依次縫合腹膜層、腹壁肌肉、皮下組織及皮膚，常規(guī)消毒手術區(qū)域。手術后注射40萬單位青霉素肌肉內(nèi)注射3～4 d，防止感染，促進傷口愈合。見圖2。

圖2 兔VX2肝癌模型建立

1.4 增強CT掃描及血管造影 造模后第7、14天按1.3中的方法麻醉實驗兔，取仰臥位固定于檢查床。采用西門子Somatom Definition雙源CT做上腹部增強掃描，觀察腫瘤成瘤及其生長情況。掃描參數(shù)為：80 KV，120 mA，F(xiàn)OV25，層厚為1.5 mm，層間距為3 mm。造影劑為碘克沙醇(美國GE)，給藥速度為0.5 mL/s，造影劑總量為8 mL。從推造影劑第20～35秒掃描動脈期，第35～60秒掃門靜脈期，第90～100秒掃延遲期。血管造影：右側腹股溝區(qū)剪毛、備皮，常規(guī)消毒鋪巾。在股動脈搏動最強點處皮膚上作一長約3～4 cm的切口，分離股動脈，兩端穿以絲線備用。運用Seldinger法穿刺右側股動脈，送入短導絲，插入5 F導管鞘，經(jīng)導管鞘直接將2.7 F的微導管送入腹主動脈內(nèi)，約在第12胸椎水平進行造影，尋找腹腔干的位置，在腹腔干位置造影。將微導管插入腹腔干造影，確認肝動脈的開口及走向，將微導管超選至肝動脈進行造影，觀察有無腫瘤染色區(qū)域。造影結束后拔出導管，用絲線結扎股動脈，縫合皮下組織及皮膚。見圖3。

圖3 血管造影過程

1.5 病理學檢查 對實驗兔實施安樂死，然后解剖其尸體，觀察腫瘤的數(shù)目、大小、質地以及轉移情況；選取腫瘤邊緣魚肉樣的具有活性的癌組織以及周圍的癌旁組織，制作石蠟切片并進行HE染色，在顯微鏡下觀察腫瘤細胞的形態(tài)。

2 結果

2.1 一般情況 40只實驗兔在接種腫瘤后1～3 d均出現(xiàn)活動度減少，精神萎靡，進食少等癥狀；術后4～7 d逐漸恢復，未出現(xiàn)嚴重的不良事件。腫瘤成瘤后，隨著腫瘤的生長及遠處轉移，實驗兔逐漸出現(xiàn)進食少、體重逐漸減輕、精神萎靡等，最終表現(xiàn)為惡病質。

2.2 腫瘤生長情況 兔后腿肌肉內(nèi)腫瘤大約14 d能觸及1 cm左右的小結節(jié)，大約在21 d后可觸及2～4 cm的結節(jié)。開腹種植術后7 d左右，做增強CT掃描發(fā)現(xiàn)，實驗兔肝臟內(nèi)有1～2 cm的病灶，約2～3周后病灶內(nèi)部開始出現(xiàn)壞死，且腫瘤組織生長迅速；3周后腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)大片壞死，腫瘤生長速度進一步加快。

2.3 影像學評估

2.3.1 CT表現(xiàn) 平掃時病灶表現(xiàn)為肝實質內(nèi)類圓形低密度影，邊界清楚，增強掃描時動脈期病灶邊緣明顯強化，門靜脈期及延遲期病灶造影劑迅速清退；部分實驗兔發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)轉移灶及增大淋巴結影。見圖4。

圖4 CT表現(xiàn)

2.3.2 血管造影表現(xiàn) 肝動脈及其分支迂曲、增粗，可見大量病理血管顯影，腫瘤染色征象明顯；腫瘤血管主干被瘤體推壓呈典型“抱球征”改變，其外周可見從環(huán)繞的腫瘤主干血管上分出的腫瘤滋養(yǎng)血管繞行腫瘤，從周邊向中心推進，形成不同厚度的環(huán)圈形周邊深染、中心相對淡染的腫瘤染色結節(jié)。分支深入腫瘤內(nèi)部，部分可見“血池征”。經(jīng)碘化油栓塞后，腫瘤血供明顯減少。見圖5。

圖5 血管造影表現(xiàn)

2.4 病理學表現(xiàn) 40只實驗兔均成瘤，32只觀察到肝臟單個病灶；有5只觀察兩個病灶，有3只觀察到兩個以上的病灶；有4只觀察到腹膜轉移灶；有2只觀察到腹壁轉移灶。

2.4.1 大體表現(xiàn) 后大腿肌肉內(nèi)腫瘤表現(xiàn)為突出于體表的軟組織結節(jié)，質地稍硬，邊界不清。將腫瘤組織剝離后腫瘤表面可見粗大、迂曲的供血血管；腫瘤被完整的纖維包膜包被，可見魚肉樣的腫瘤組織與正常肌肉組織的明顯分界。肝臟內(nèi)腫瘤表現(xiàn)為團塊狀的腫瘤組織，呈灰白色，與肝實質分界清晰，有包膜；腫瘤內(nèi)部壞死物質呈豆腐渣樣，有活性的腫瘤組織表為魚肉樣。見圖6。

圖6 腫瘤大體圖片

2.4.2 鏡下表現(xiàn) 顯微鏡下觀察到腫瘤與正常組織以纖維包膜分隔，纖維包膜內(nèi)可見明顯增大的腫瘤細胞，細胞核增大、細胞異型明顯、排列紊亂、呈巢狀分布或彌漫分布；腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)片狀變性、壞死、結構不清的區(qū)域。見圖7。

圖7 腫瘤組織的HE染色結果(200 ×)

3 討論

目前較為常用的肝癌研究的實驗動物主要是鼠類、兔、豬、犬等，其中兔體型適中，便于介入操作、飼養(yǎng)方便，被廣泛應用于腫瘤介入及影像方面的實驗研究中[4-5]。肝癌模型的建立方法有：①化學誘導模型。②基因工程小鼠模型。③移植瘤模型[6-8]。本研究中采用的是移植瘤模型的方法，該方法實體腫瘤的組織或細胞植入實驗動物體內(nèi)，建立的腫瘤模型更加貼近人類實體癌癥的本質。

VX2腫瘤模型歷史悠久，它可以植入到肝、腎、肺等多種器官內(nèi)，但這個模型只能建立在兔子的基礎上。VX2的肝腫瘤模型主要由肝動脈血液供應,其快速增長證明了該模型類似于人類肝細胞癌的特征[8]。本課題組研究臭氧治療腫瘤的進展時發(fā)現(xiàn)VX2腫瘤模型被廣泛應用于動物實驗[9]。兔VX2肝癌模型的建立方法包括：影像設備引導下經(jīng)皮穿刺種植法、開腹手術種植法、移植腫瘤組織塊和接種腫瘤細胞懸液法等[10-12]。經(jīng)皮穿刺種植法手術時間短、感染風險低且節(jié)約實驗成本；但針道種植轉移、異位種植的幾率較高。開腹手術種植成瘤率高、準確度高、異位種植風險低，不過手術耗時長、感染風險高。多項研究表明腫瘤組織塊接種法成瘤率更高、成瘤的時間較短，可節(jié)約實驗時間[13]。也有研究表明超聲引導經(jīng)皮穿刺腫瘤組織條種植法對肝組織的損傷小,成功率高、模型性質穩(wěn)定[14]。目前兔VX2肝癌模型已在介入治療、影像醫(yī)學以及外科手術等方面研究中廣泛應用，Doemel等[15]和Berz等[16]通過VX2肝腫瘤模型來研究不同化療栓塞方案對肝腫瘤代謝以及免疫的影響；Van等[17]利用VX2腫瘤模型發(fā)現(xiàn)碘油可以作為cTACE治療效果的成像生物標志，為臨床肝癌患者的治療管理起到了很大的幫助。Murai等[18]在研究射頻消融聯(lián)合順鉑對肺癌的治療效果時同樣采用了VX2肺腫瘤模型。VX2腫瘤模型的建立方法較多，在以往的研究中，兔肝臟VX2腫瘤的誘導途徑有多種，包括剖腹和經(jīng)皮穿刺植入腫瘤細胞懸液和腫瘤碎片懸液[19]。曾功君等[20]在很早前就比較了超聲引導下腫瘤組織混懸液注射法、手術直視下腫瘤組織塊包埋、手術直視下腫瘤組織混懸液注射法三種方式的成瘤概率，結果發(fā)現(xiàn)手術直視下腎內(nèi)VX2腫瘤組織混懸液注射法建立兔腎VX2腫瘤模型的成功率較其他兩種方法高。本研究應用的是開腹種植腫瘤組織塊法，所有實驗兔均成瘤(100%)，根據(jù)經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長速度和大小與接種瘤塊的數(shù)目、大小有著密切的聯(lián)系。瘤塊較大、接種數(shù)目越多的腫瘤生長速度越快。

B超是肝癌的首選普查方法，CT可以明確腫瘤生長的位置、大小、形態(tài)及血供情況，評估療效等。DSA能夠較好的顯示腫瘤血管染色征象，直觀地顯示腫瘤的血供情況以及評估TACE術后有無新生血管的形成。現(xiàn)在對于兔VX2肝癌血管造影有兩種方法，一種是采用Seldinger法經(jīng)股動脈穿刺插管[21]，另一種是開腹經(jīng)腹腔干或肝動脈直接插管[22]。也有研究通過顯微手術的方法，通過胃十二指腸動脈留置導管插管[23]。本研究采用的是Seldinger法經(jīng)股動脈穿刺插管，首先暴露了實驗兔的右側股動脈，這與臨床上直接經(jīng)皮穿刺有所不同，主要是由于兔的皮膚較厚，不便于直接穿刺操作。其次是要熟練實驗兔的血管解剖結構，以便于更加精確而迅速地完成操作，減少術中出血。

4 結論

開腹種植腫瘤組織塊是目前首選的建模方法，研究人員可根據(jù)自己的實驗需求選擇適合的建模方法。開腹手術種植腫瘤組織塊法是一種較為完善的建模方法，成瘤率較高；兔VX2肝癌移植瘤模型是一種富血供腫瘤，主要由肝動脈供血；動態(tài)增強CT掃描能夠實時的監(jiān)測腫瘤的生長情況，在術前、術后評價方面具有重要價值，但是血管造影在顯示腫瘤的供血動脈等方面仍具有優(yōu)勢，并且血管造影同時能兼顧治療的作用。