花椒HPLC指紋圖譜建立及指標(biāo)性成分的測定

張萌萌，李朝敏，吳博，盧烽，吳純潔

（成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，成都 611137）

花椒為蕓香科花椒屬植物花椒（Zanthoxylum bungeanum.Maxim）的干燥成熟果皮，主要分布于四川、甘肅、陜西、河北、河南等地［1，2］?；ń饭な浅Ｓ玫氖称泛椭兴幣淞希蚱洫毺氐摹奥?、香”味而深受人們喜愛，被譽(yù)為“八大調(diào)味品”之一［3，4］。由于市場上不同品種花椒混種、混收、以次充好，導(dǎo)致市面上的花椒食品質(zhì)量良莠不齊。GB／T 30391－2013以揮發(fā)油含量為依據(jù)，將干花椒分為一級（≥3.0mL／100g）、二級（≥2.5mL／100g）2個等級；SB／T 10040－1992以花椒揮發(fā)油含量＞2.5%作為花椒的質(zhì)量控制指標(biāo)。由此可知，花椒食品的質(zhì)量控制主要集中于揮發(fā)油含量測定方面，缺乏整體評價方法，難以全面反映其內(nèi)在品質(zhì)。

指紋圖譜是隨著現(xiàn)代新技術(shù)發(fā)展而誕生的一種從整體上研究復(fù)雜物質(zhì)體系的技術(shù)，已經(jīng)在中藥質(zhì)量控制、食品評價、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［5，6］。指紋圖譜技術(shù)在食品中的應(yīng)用，可以對食品品質(zhì)及其特色成分鑒別提供參考數(shù)據(jù)。本文采用HPLC技術(shù)建立花椒指紋圖譜，采用相似度分析和聚類分析對花椒指紋圖譜進(jìn)行分析，并進(jìn)一步對其主要化學(xué)成分進(jìn)行鑒定及含量測定，從而為花椒食品的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

Shimadzu LC-10A高效液相色譜儀 日本島津公司；Sartorius BP 211D電子天平（十萬分之一） 德國賽多利斯公司；HH-4恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；UPT-11-10T優(yōu)普系列超純水器 四川優(yōu)普超純科技有限公司；HX-200型高速中藥粉碎機(jī) 浙江省永康市溪岸五金藥具廠。

1.2 材料與試劑

16批花椒樣品信息詳情見表1。

表1 16批不同產(chǎn)地花椒樣品Table1 Information of 16samples of Z.bungeanum from different areas

羥基-α，β-山椒素對照品（純度＞98%）：實驗室自制；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：購自Sigma公司；乙醇、甲醇（分析純）：購自成都市科龍化工試劑廠。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件

Wondasil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脫；流速0.8mL／min；柱溫30℃；檢測波長268nm；進(jìn)樣量10μL。洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度洗脫程序Table2 Gradient elution program of moving phase

續(xù) 表

2.1.2 供試品溶液的制備

稱取花椒粉末（過3號篩）約0.5g，精密稱定，置于50mL錐形瓶中，加30倍量50%的乙醇，回流提取30min，取出，放至室溫，過濾；濾渣繼續(xù)加20倍量50%的乙醇，回流提取30min，取出，放冷，過濾，合并2次濾液，定容至50mL容量瓶中，經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 精密度考察

稱取花椒粉末（S1）約0.5g，精密稱定，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以4號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性考察

稱取花椒粉末（S1）6份，每份約0.5g，精密稱定，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)行測定分析，以4號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，表明此方法重復(fù)性好，適合花椒指紋圖譜的研究。

2.1.5 穩(wěn)定性考察

稱取花椒粉末（S1）約0.5g，精密稱定，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件分別于0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0h測定峰面積，以4號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，表明花椒供試品溶液在8h穩(wěn)定。

2.1.6 指紋圖譜的建立［7］

稱取16批花椒粉末各約0.5g，精密稱定，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣，記錄各樣品色譜圖，得到16批花椒樣品的指紋圖譜，見圖1。將其導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2004A版），以表3中S3為參照圖譜，時間寬度設(shè)定為0.10，多點校正后，進(jìn)行分析，生成花椒共有模式對照指紋圖譜，標(biāo)定12個峰，見圖2。各批次樣品色譜圖與對照指紋圖譜相似度結(jié)果見表3。

圖1 16批花椒樣品指紋圖譜疊加圖Fig.1 Overlay chart of HPLC fingerprint of 16batches of Z.bungeanum

圖2 花椒對照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint of Z.bungeanum

表3 16批花椒對照指紋圖譜相似度Table3 Similarity of HPLC fingerprint of 16batches of Z.bungeanum

由表3可知，16批花椒樣品的相似度較好，均大于0.90，表明各產(chǎn)地的花椒質(zhì)量具有較高的一致性。

2.1.7 聚類分析［8］

聚類分析是一種無指導(dǎo)、探索性的模式識別方法，以所得樣品的色譜指紋圖譜為特征，對樣品進(jìn)行分類。本研究應(yīng)用SPSS軟件，將各色譜峰占總色譜峰的峰面積進(jìn)行量化，利用 Word法，以平方Euclidean Distance為測量度對花椒樣品進(jìn)行聚類分析，見圖3。

圖3 16批花椒樣品聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram for 16batches of Z.bungeanum

由圖3可知，當(dāng)類間距離為20時，16批花椒樣品被分為2大類：S1，S12，S14，S16聚集為一類；S2～S11，S13，S15聚集為一類。當(dāng)類間距離為10時，16批花椒樣品被分為3大類：S2～S11，S13，S15聚為一類；S1，S12，S14聚為一類；S16單獨為一類。同一產(chǎn)地的花椒樣品相似度較好，但是亦被聚類分析劃分為不同的類別，說明同一產(chǎn)地花椒既具有一致性也存在一定的差異。

2.2 樣品成分含量的測定

2.2.1 色譜條件

Wondasil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-水（B）為40∶60；流速1.0mL／min；柱溫30℃；檢測波長270nm；進(jìn)樣量10μL。

2.2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取羥基-α，β-山椒素對照品適量，加甲醇制成濃度分別為120，160μg／mL的混合對照品儲備液，4℃保存，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取花椒粉末（過3號篩）約0.5g，置于50mL的具塞試管中，加30倍量甲醇，連續(xù)超聲提取2次，每次60min，過濾，合并2次濾液，定容至50mL容量瓶中，經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對照品儲備液0.25，0.625，1.25，2.0，2.5mL于5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。精密吸取系列對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，并記錄峰面積。分別以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得羥基-α-山 椒 素、羥 基-β-山 椒 素 的 回 歸 方 程 分 別 為Y＝79234X＋12078（R2＝0.9994）、Y＝71625X－12760（R2＝0.9993），線性范圍分別在6～60μg／mL，8～80μg／mL。

2.2.5 精密度試驗

精密吸取羥基-α，β-山椒素混合對照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。羥基-α，β-山椒素峰面積的RSD值分別為1.26%，1.12%，表明該儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗

稱取花椒粉末6份，每份0.5g，精密稱定，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進(jìn)行測定分析。供試品溶液中羥基-α，β-山椒素峰面積的RSD值分別為1.98%，1.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗

稱取花椒粉末約0.5g，精密稱定，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件分別于0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0h測定峰面積。供試品溶液中羥基-α，β-山椒素峰面積的 RSD值分別為2.15%，1.58%，表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的花椒粉末0.5g，共6份，精密加入質(zhì)量濃度分別為48，64μg／mL的羥基-α，β-山椒素混合對照品溶液30mL，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進(jìn)行測定。羥基-α，β-山椒素的平均回收率分別為95.02%，97.43%；RSD值分別為2.65%，2.54%，表明該方法準(zhǔn)確度較好。

2.2.9 含量的測定

稱取花椒粉末約0.5g，精密稱定，按照2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，計算花椒中主要成分羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素的含量，色譜圖見圖4，結(jié)果見表4。

圖4 混合對照品（A）和花椒（B）HPLC圖Fig.4 HPLC of reference substances（A）and Z.bungeanum（B）

表4 花椒各主要成分含量測定結(jié)果Table4 Determination of content of main components in Z.bungeanum%

續(xù) 表

不同產(chǎn)地16批次花椒樣品的2個主要成分羥基-α-山椒素的含量在0.323%～1.570%，羥基-β-山椒素的含量在0.03%～0.622%，含量總和在0.440%～2.179%，其中以四川鹽源、漢源含量最高，陜西韓城含量最低，說明不同產(chǎn)地花椒的主要成分羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大。

3 討論

本研究考察了提取方法（超聲、回流、冷浸）、提取溶劑（水、50%乙醇、乙醇）、提取時間（15，30，60min）、流動相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%三乙胺）、波長（220，254，268nm）、柱溫（25，30，35 ℃）、流速（0.8，1.0，1.2mL／min），結(jié)果表明：采用50%乙醇回流提取30min時，提取較完全，雜質(zhì)少，分離效果較好；流動相為乙腈-水，梯度洗脫，檢測波長268nm，柱溫30℃，流量0.8mL／min時，所得圖譜的分離效果、基線、峰形等均較好，色譜信息豐富。

本研究建立了16批不同產(chǎn)地花椒HPLC指紋圖譜，共標(biāo)定12個共有峰，并利用相似度評價和聚類分析對花椒HPLC指紋圖譜進(jìn)行研究。16批花椒樣品的相似度均大于0.9，表明不同產(chǎn)地的花椒樣品質(zhì)量較好；當(dāng)類間距離為10時，16批花椒樣品被分為3大類：S2，S3，S4～S11，S13，S15聚為一類；S1，S12，S14聚為一類；S16單獨為一類。花椒中主要成分羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素的含量總和在0.440%～2.179%。通過分析，發(fā)現(xiàn)同一產(chǎn)地花椒指紋圖譜的相似度及分類亦有一定的差異，如陜西韓城花椒相似度在0.904～0.935，其主要成分的含量在0.440%～0.821%，兩者跨度均較大，可能是由于采收季節(jié)的不同或栽培管理方式的不一致造成的，同時進(jìn)一步說明本研究建立的花椒指紋圖譜用于花椒食品質(zhì)量控制具有積極的意義。

食品質(zhì)量控制是保證食品安全、營養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但是目前食品質(zhì)量控制大多是通過感官評價或單一成分的含量測定來分析食品的風(fēng)味及質(zhì)量［9］，該評價方法單一且不能全面反映其內(nèi)在品質(zhì)。本研究建立了多個指標(biāo)成分結(jié)合指紋圖譜來控制花椒食品質(zhì)量的方法，彌補(bǔ)了單一揮發(fā)油指標(biāo)控制花椒食品質(zhì)量的缺陷，同時對花椒食品質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)的建立具有重要意義。