產(chǎn)氨基甲酸乙酯降解酶酵母菌的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

周雪燕，辛敏漢，肖婧，程衛(wèi)東，史學(xué)偉＊

（1.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué) 信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 石河子 832000）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，常簡稱為 EC），又名脲烷（urethane），是煙草葉及香煙的天然成分，也是發(fā)酵食品［1］與酒精飲品［2］發(fā)酵或貯存過程中的伴隨產(chǎn)物［3，4］。20世紀(jì)40年代，Nettleship實(shí)驗證明 EC具有致癌作用，EC可以引起肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等?，F(xiàn)今EC被廣泛用于工業(yè)涂料及動物麻醉［5］。作為一種水溶性的致癌物質(zhì)，已成為2002年FAO重點(diǎn)監(jiān)控物質(zhì)，國際標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定其含量不得超過20μg／L［6］。就食品行業(yè)而言，面包、醬油、葡萄酒、中國黃酒等生活必需品不斷發(fā)展，其伴隨產(chǎn)物EC的產(chǎn)生是無法避免的，對食品及飲料中的EC采取適宜又安全的方法將其含量降低至安全限量以下具有實(shí)質(zhì)性的必要。

目前研究的降解或控制氨基甲酸乙酯的生成有多種方式，主要從控制EC前體物質(zhì)、控制EC的產(chǎn)生條件和使用EC水解酶直接去除3個方面進(jìn)行處理。如通過控制發(fā)酵食品的發(fā)酵條件、向食品中添加脲酶、選育低產(chǎn)尿素酵母菌來進(jìn)行發(fā)酵等方法來減少發(fā)酵產(chǎn)酒時生成氨基甲酸乙酯的問題。研究表明，生物酶法降解EC是一種溫和、安全有效的方法。綜上所述，篩選產(chǎn)EC降解酶酵母菌株并研究其產(chǎn)酶特性具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

選取保藏于石河子大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗室的酵母菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD）［7］：瓊脂2.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，酵母浸粉1.0%，用蒸餾水配制，自然pH，121℃高壓滅菌20min。

篩選培養(yǎng)基：氨基甲酸乙酯（EC）2.5～20g／L，氯化鈉2g／L，硫酸銨4g／L，磷酸二氫鉀2.5g／L，磷酸氫二銨10g／L，七水合硫酸鋅0.2g／L，七水合硫酸鎂0.5g／L，七水合硫酸亞鐵0.05g／L，四水合硫酸錳0.15g／L，瓊脂粉20g／L，pH 5.0。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，自然pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母浸粉2%，自然pH，EC 5g／L。

1.1.3 主要試劑與儀器

氨基甲酸乙酯、甲酰胺、氨基甲酸甲酯、N-甲基乙酰胺：美國Sigma公司；乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、亞硝基鐵氰化鈉、苯酚、次氯酸鈉、氫氧化鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

5810R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf儀器公司；LAC-5040S全自動高壓滅菌鍋 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；CX21FS1光學(xué)顯微鏡 Olympus公司；722紫外分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TC-512PCR擴(kuò)增儀 英國 Techne公司；Power Pac Universal水平電泳儀、Gel DOC X0R凝膠成像系統(tǒng) 美國BioRad公司。

顯色劑Ⅰ：稱取30g苯酚和1.25g亞硝基鐵氰化鈉溶于超純水并定容至500mL后冷藏于冰箱。顯色劑Ⅱ：稱取26.25g氫氧化鈉和15mL次氯酸鈉超純水定容至500mL后冷藏于冰箱。終止劑：10%的TCA。底物溶液：用0.05mol／L磷酸緩沖液（pH 7.0）配制成3%EC溶液后冷藏。

1.2 方法

1.2.1 EC降解菌株的篩選

將保藏的36株菌株接種于YPD培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)24h，挑取單菌落，再以EC為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24h后，選取既可以在高濃度EC又可以在低濃度EC篩選培養(yǎng)基上生長的菌株作為EC降解菌株。

1.2.2 菌株的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

EC降解菌株的DNA采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取，根據(jù)試劑盒提供藥品及方法提取。

PCR 擴(kuò)增如下［8］：

上游引物：ITS1（5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇）；

下游引物：ITS4（5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇）。

擴(kuò)增體系：總體積為50μL：2μL的模板DNA，2μL的上游引物，2μL的下游引物，25μL的Easy Taq Supermix，19μL的ddH2O，并做空白對照。

將符合標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序結(jié)果在NCBI（National Center for Biotechnology Information）BLAST中進(jìn)行同源序列比對：下載相似性在99%以上菌種的序列，連同測序菌株的序列用Claustal X1.83軟件進(jìn)行多序列比對，結(jié)果采用MEGA 6.0軟件中的鄰近法（Neighbor-Joining）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，并用Bootstrap對進(jìn)化樹進(jìn)行1000次置信度分析［11］。

1.2.3 EC降解酶活力測定方法

1.2.3.1 酶活測定步驟

準(zhǔn)確吸取200μL酶液于比色管中（空白對照：將酶液在沸水中保溫20min，使酶液失活），加入800μL底物溶液，30℃水浴20min后加1mL終止劑終止反應(yīng)?；靹蚝蠹尤?mL顯色劑Ⅰ，混勻后再加1mL顯色劑Ⅱ混勻，30℃水浴保溫20min，用超純水定容至10mL，測定OD625。

式中：ΔOD625為測定的EC降解酶反應(yīng)后與空白樣品光密度之差；n為酶活測定液稀釋倍數(shù)；k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的倒數(shù)；10為樣品的稀釋倍數(shù)；20為酶作用的時間（min）。

1.2.3.2 NH4＋標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 NH4＋標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線Fig.1 NH4＋ standard curve

將氨水配成0.1mol／L的NH4＋溶液，再分別配制成0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mmol／L 的 NH4＋標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取1mL標(biāo)準(zhǔn)濃度NH4＋溶液，分別置于編號的比色管中，在50℃下水浴30min，加入1mL終止液，充分混勻，再依次加入1mL顯色劑Ⅰ和顯色劑Ⅱ振蕩并充分混勻，反應(yīng)20min，用超純水定容至10mL，在625nm下比色測定OD值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，NH4＋標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1。

1.2.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

熱敏灸聯(lián)合枇杷清肺飲加減方治療尋常性痤瘡的臨床觀察…………………………………………………… 黃 青等（2）：229

1.2.4.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

碳源及其濃度對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：將蔗糖、麥芽糖、葡萄糖作為培養(yǎng)基中的碳源物質(zhì)（總量均為20g／L），菌株按4%的接種量接種，在30℃，200r／min條件下?lián)u床震蕩培養(yǎng)4天，分別取樣測定其發(fā)酵產(chǎn)酶情況。篩選出合適的碳源之后，將其碳源濃度分別設(shè)置為10，20，30，40，50，60g／L，得到菌體發(fā)酵產(chǎn)酶最佳時的碳源濃度。

氮源及其濃度對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：以葡萄糖為碳源，分別用不同的氮源：酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、硫酸銨＋酵母粉、蛋白胨＋硫酸銨、酵母粉＋蛋白胨＋硫酸銨（1∶1∶2）代替搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源物質(zhì)，其余條件同上，按期取樣測定菌株的產(chǎn)酶情況。選出合適的氮源之后，設(shè)置不同的氮源濃度10，20，30，40，50，60，70g／L來研究其對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

無機(jī)鹽對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加 濃 度 為 1mmol／L 的 CuSO4，F(xiàn)eSO4，ZnSO4，MnSO4，KH2PO4及CaCl2，以不添加無機(jī)鹽的培養(yǎng)基作為空白對照，其他條件均相同，考察無機(jī)鹽對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶情況的影響。

底物濃度對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：分別在對數(shù)中期向培養(yǎng)基中添加濃度為2.5，5.0，7.5，10.0g／L的底物EC，以不添加EC為對照，考察初始底物濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.2.4.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

將菌株按4%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃，200r／min搖床震蕩培養(yǎng)，發(fā)酵過程中每隔12h取樣測定其發(fā)酵產(chǎn)酶量。

將菌株按4%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于25，28，30，33，35℃，200r／min搖床震蕩培養(yǎng)，測定同上。

將菌株按4%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始 pH 分別為 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，在30℃，200r／min條件下?lián)u床震蕩培養(yǎng)，測定同上。

將菌株按4%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始 pH 6.0，裝液量分別為10%，20%，30%，40%，50%，60%，于30℃，200r／min搖床震蕩培養(yǎng)，測定同上。

按接種量分別為2%，4%，6%，8%，10%，12%將菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基初始pH 6.0，裝液量75mL，在30℃，200r／min搖床震蕩培養(yǎng)，測定同上。

1.2.5 正交試驗驗證

采用正交試驗對其顯著的因素進(jìn)行試驗設(shè)計，并進(jìn)行驗證。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取底物濃度、培養(yǎng)時間、初始pH、裝液量、溫度、氮源濃度6個因素為考察對象，以及各個因素最優(yōu)的3個水平，以發(fā)酵產(chǎn)酶能力為評價指標(biāo)，進(jìn)行6因素3水平L18（37）正交試驗。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 8.0軟件進(jìn)行單因素分析，用DPS軟件進(jìn)行正交分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn) EC降解酶酵母菌的篩選與鑒定［12－14］

將實(shí)驗室已存的36株酵母菌在篩選培養(yǎng)基上初步篩選得到6株產(chǎn)EC降解酶菌株，分別為N6，P2，Y13，Y18，Y4，Y9。增加EC濃度，對6株菌進(jìn)一步復(fù)篩，結(jié)果表明 Y4，Y9，Y13，N6在EC最高濃度為17.5g／L的培養(yǎng)基上正常生長，菌落形態(tài)見圖2。

圖2 酵母菌菌落形態(tài)Fig.2 Yeast colony morphology

2.2 16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

提取菌株N6，Y13，Y9，Y4的DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)展，將PCR擴(kuò)展產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖3。4株菌在500～600bp之間出現(xiàn)了特異性條帶，明亮清晰，符合測序標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測圖Fig.3 The electrophoretogram of 16SrDNA amplification products

2.3 酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖4 酵母菌ITS系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of yeast ITS

由圖4可知，供試菌株Y13，N6，Y9，Y4與Pichia kudriavzevii SZCPYZJ1 同源性強(qiáng)，屬于 Pichia kudriavzevii（庫德里阿茲威氏畢赤酵母）。通過系統(tǒng)發(fā)育分析4株供試菌株均屬于1個屬，且均在EC濃度為17.5g／L的培養(yǎng)基上正常生長，因此選取其中生長活性較好的菌株Y13進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.4 發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.4.1 不同碳源及碳源濃度對Y13產(chǎn)酶能力的影響

圖5 不同碳源對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響（A）和不同碳源濃度對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響（B）Fig.5 Effects of different carbon sources on enzyme production ability of yeast（A）and the effects of different carbon sources concentration on enzyme production ability of yeast（B）

由圖5中A可知，在蔗糖、葡萄糖和麥芽糖3種碳源中，菌株Y13在以麥芽糖為碳源時產(chǎn)酶活性最好，其次是蔗糖，最后是葡萄糖。由此表明，雙糖比單糖更易被Y13利用。由圖5中B可知，以麥芽糖為Y13碳源，當(dāng)其濃度為10g／L時，酶活最高，這是因為碳源濃度過高會提高培養(yǎng)基中的滲透壓，抑制微生物的生長。

2.4.2 不同氮源及其濃度對Y13產(chǎn)酶能力的影響

圖6 不同氮源對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響（A）和不同氮源濃度對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響（B）Fig.6 Effects of different nitrogen sources on enzyme production ability of yeast（A）and the effects of different nitrogen sources concentration on enzyme production ability of yeast（B）

由圖6中A可知，在供試的7種不同配比的氮源中，Y13在單獨(dú)以酵母粉為氮源發(fā)酵時，產(chǎn)酶的酶活最優(yōu)；以酵母粉為氮源。由圖6中B可知，當(dāng)酵母粉濃度為30g／L時，Y13的發(fā)酵產(chǎn)酶能力最好。2.4.3 不同無機(jī)鹽對Y13產(chǎn)酶能力的影響

圖7 不同無機(jī)鹽對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響Fig.7 Effects of different inorganic salts on enzyme production ability of yeast

由圖7可知，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加6種不同無機(jī)鹽，以不添加無機(jī)鹽為空白對照，結(jié)果表明無機(jī)鹽的有無對Y13發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活影響不大，因此在培養(yǎng)菌株Y13時無機(jī)鹽對其影響不作考慮。

2.4.4 不同底物濃度對Y13產(chǎn)酶能力的影響

圖8 不同底物濃度對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響Fig.8 Effects of different substrate concentration on enzyme production ability of yeast

在菌株Y13的搖瓶發(fā)酵試驗時，培養(yǎng)基中含有底物EC。而不同的底物濃度對菌株Y13的發(fā)酵產(chǎn)酶情況有著較大的影響。由圖8可知，底物濃度為5.00%時，Y13菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活最高。

2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.5.1 接種量與培養(yǎng)時間對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響

由圖9中A可知，接種量為6%時，酵母菌的產(chǎn)酶能力最佳，且提升顯著。由圖9中B可知，隨著培養(yǎng)時間的增長，菌株的生長活性逐漸增加，當(dāng)培養(yǎng)至115h時生長活性最強(qiáng)，之后隨著時間延長，生長活性也隨之降低。

圖9 不同接種量與培養(yǎng)時間對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響Fig.9 Effects of different inoculum size and culture time on yeast enzyme-producing ability

2.5.2 初始pH與裝液量對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響

由圖10中A可知，隨著初始pH值的增加，菌株的生長活性也隨之上升，當(dāng)初始pH為6時，菌株的生長活性最佳。由圖10中B可知，當(dāng)裝液量在20%時菌株的生長活性最為旺盛，但20%以后菌株的生長活性逐漸降低。

圖10 不同pH值與裝液量對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響Fig.10 Effects of different pH values and liquid volume on yeast enzyme-producing ability

2.5.3 不同溫度對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響

圖11 不同溫度對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響Fig.11 Effect of different temperatures on yeast enzyme-producing ability

由圖11可知，菌株在30℃環(huán)境下生長活性最好，與通常的酵母菌最佳生長溫度基本一致。

2.5.4 Y13菌株產(chǎn)酶條件正交試驗分析

表1 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table1 Optimization of orthogonal test results and analysis of enzyme production conditions

續(xù) 表

由表1正交表極差分析可知，對Y13菌株產(chǎn)酶影響的重要性為D＞E＞A＞B＞C＞F，即裝液量＞底物濃度＞培養(yǎng)時間＞初始pH＞培養(yǎng)溫度＞氮源濃度。由正交試驗可知菌株Y13產(chǎn)酶最佳條件為D3E2A1B3C2F2，即培養(yǎng)溫度為28℃，初始pH為6，裝液量為20%，底物濃度為5.00%，氮源濃度為30g／L的條件下培養(yǎng)120h時菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶情況最佳。綜合單因素優(yōu)化和正交優(yōu)化的結(jié)果，菌株Y13的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：麥芽糖濃度為10g／L，酵母粉濃度為30g／L，接種量為6%，培養(yǎng)基中的底物濃度為5.00%，裝液量為20%，初始pH為6，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為120h。

3 結(jié)論

發(fā)酵食品和酒精飲料的加工過程中會產(chǎn)生EC，酒精又會促進(jìn)EC的致癌作用，隨著人們生活水平的提高，酒精飲料和發(fā)酵食品的消費(fèi)量增大，對于EC降解的研究也變得至關(guān)重要。眾多研究表明，最行之有效的方法為生物降解法，而本文就產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶酵母菌的篩選、鑒定及發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究。篩選出菌株Y13，經(jīng)鑒定為庫德畢赤酵母，具有較好的發(fā)酵產(chǎn)酶能力，并且經(jīng)過單因素和正交試驗優(yōu)化，得到了該菌株的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件，為研究氨基甲酸乙酯的降解奠定了基礎(chǔ)。