加減枇杷清肺飲對ICR小鼠痤瘡模型NLRP3炎性小體及其下游因子的影響?

陳 茜，刁慶春，韓曉鳳，王思平，江 雪，陶春蓉

(重慶市中醫(yī)院,重慶市第一人民醫(yī)院皮膚科,重慶 400011)

尋常痤瘡是最常見的皮膚疾病之一，目前患痤瘡的青少年占80%以上,成人痤瘡有上升趨勢，其中18～37歲的女性痤瘡患病率約為23.4%～43.7%[1-2]。尋常痤瘡是一種多因素所致的炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為面部和軀干上部的粉刺、丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)、囊腫等，部分患者可導(dǎo)致嚴(yán)重的瘢痕，嚴(yán)重影響患者的容貌及身心健康[3-5]。而存在于毛囊皮脂單位中的痤瘡丙酸桿菌是痤瘡的主要致病因素。NLRP3是NOD 樣受體(NLR)家族的成員，其在體內(nèi)的表達(dá)水平及其在不同疾病狀態(tài)中的研究已成為熱點(diǎn)。NLRP3激活后與銜接分子ASC及效應(yīng)分子Pro-Caspase-1形成炎性小體，形成成熟的Caspase-1，Caspase-1是最具特征性的促炎反應(yīng)蛋白，可進(jìn)一步加工處理細(xì)胞因子IL-1β前體產(chǎn)生IL-1β,引起機(jī)體炎癥反應(yīng)[6]。已有研究顯示，NLRP3炎性小體參與痤瘡的發(fā)病機(jī)制，痤瘡患者皮損中NLRP3、Caspase-1及IL-1β均呈增加趨勢，臨床中加減枇杷清肺飲治療尋常痤瘡療效較好。本次研究利用痤瘡丙酸桿菌建立ICR小鼠痤瘡模型，初步探索了加減枇杷清肺飲對NLRP3炎性小體及其下游因子Caspase-1和IL-1β的影響。

1 材料

1.1 主要儀器與試劑

酶標(biāo)儀購自普朗；熒光定量PCR儀購自羅氏公司；細(xì)胞裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、β-actin抗體均購自碧云天生物技術(shù)研究所；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTM、RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TAKARA公司;NLRP3、caspase-1、IL-1β一抗購自abcam公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠、山羊抗兔二抗購自Santa公司；所有引物均合成于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

6～8周齡雌性ICR小鼠36只，體質(zhì)量35～45 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)條件為SPF級飼養(yǎng)，采用架式籠養(yǎng)，正常給予水和食物，室內(nèi)飼養(yǎng)溫度(25±1)℃，濕度50%～60%。

1.3 痤瘡丙酸桿菌混懸液制備

痤瘡丙酸桿菌(中國藥品生物制品檢定所，ATCC6919)厭氧條件4 ℃保存。混懸液制備時取痤瘡丙酸桿菌菌株1株，在腦心浸液培養(yǎng)基中37 ℃轉(zhuǎn)種活化并增殖，收集菌落洗滌過濾，PBS調(diào)整痤瘡丙酸桿菌濃度(1×108CFU/20 μL)。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物

四環(huán)素混懸液制備,四環(huán)素片(山西云鵬制藥有限公司生產(chǎn))每片劑量0.25 g，根據(jù)使用說明書使用。按體表面積折算小鼠等效劑量為每日0.126～0.257 g/kg，據(jù)此確定陽性對照藥四環(huán)素組給藥劑量為每日0.126 g/kg。每次灌胃前均臨時配制四環(huán)素混懸液，配置方法：將劑量1片0.25 g 的四環(huán)素研磨成粉末倒入燒杯中，加入50 ml蒸餾水混勻，配置為濃度5 mg/ml的四環(huán)素懸濁液。

加減枇杷清肺飲組成：枇杷葉15 g，桑白皮15 g，黃芩15 g，梔子15 g，薏苡仁20 g，白花蛇舌草20 g，忍冬藤20 g，連翹12 g，郁金15 g，夏枯草15 g，丹參12 g，皂角刺10 g，山楂10 g，甘草6 g，方劑總量為200 g。根據(jù)“人與各種動物之間藥物劑量換算表”計(jì)算小鼠等效劑量為25.90 g/kg/d，參考已報(bào)道的文獻(xiàn)及等比原則[7]，加減枇杷清肺飲高劑量、中劑量、低劑量分別為51.80、25.90、12.95 g/kg/d。嚴(yán)格稱量方劑中的各味中藥，加蒸餾水進(jìn)行煎煮濃縮為2 g/ml，加蒸餾水配制成高(2 g/ml含生藥量)、中(1 g/ml含生藥量)、低(0.5 g /ml含生藥量)不同劑量的中藥液，以高溫蒸汽法將制備后的水煎液進(jìn)行滅菌處理，并置于-20 ℃冰箱備用。

2 方法

2.1 動物分組

ICR小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為PBS對照組、模型組、四環(huán)素組、中藥高、中、低劑量治療組6組各6只。

2.2 造模建立及治療方法

除PBS對照組外，其余各組給予痤瘡丙酸桿菌混懸液20 μl，右耳內(nèi)側(cè)同一部位皮內(nèi)注射共1次。PBS對照組給予PBS20ul皮內(nèi)注射。除PBS對照組及模型組外，其余各組動物在造模1 d后開始灌胃給藥治療，PBS對照組及模型組每日灌胃1 ml生理鹽水。四環(huán)素組按劑量每日0.126 g/kg灌胃給藥，加減枇杷清肺飲高、中、低劑量組分別給予1 ml中藥液灌胃，每日灌胃1次，各組均連續(xù)治療7 d。治療完成后，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，取耳部皮損組織及血液，采集標(biāo)本后斷頸處死各組動物。

2.3 觀測指標(biāo)及方法

2.3.1 肉眼觀察ICR小鼠耳部皮損變化 各組小鼠干預(yù)完成后肉眼觀察小鼠耳部皮損變化情況，記錄炎癥、膿腫等相關(guān)變化。

2.3.2 HE染色后光鏡下觀察組織病理變化 各組小鼠干預(yù)完成后取耳部皮損，10% 中性甲醛液固定脫水、石蠟包埋、切片，HE 染色，在光鏡下觀察各組皮損處皮膚病理學(xué)特點(diǎn)。

2.3.3 Real-time PCR檢測NLRP3、caspase-1、IL-1β轉(zhuǎn)錄水平 表1顯示，取皮損后TRIZOL法提取組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模版，Real-time PCR實(shí)時檢測熒光強(qiáng)度。Real-time PCR的反應(yīng)體系為：SYBR? Premix Ex TaqII(2×)6.25ul，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，cDNA 1 μl，dH2O(sterile distilled water)4.25 μl，總體積為12.5 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；溶解曲線95 ℃ 5s，60 ℃ 1min，95 ℃ 1s，冷卻50 ℃ 30 s。

表1 RT-PCR引物序列

2.3.4 Western blot檢測NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白水平 提取耳廓皮損總蛋白，BCA法測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離(80 V 30 min;120 V 60 min)，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜(100 V 90 min)，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別按比例配制一抗NLRP3、caspase-1、IL-1β、β-actin，于4 ℃孵育過夜，次日TBST洗7 min×4次，二抗室溫孵育1 h。TBST洗7 min×4次，加入現(xiàn)配制發(fā)光液于C-Digital western曝光儀上曝光。利用ImageJ軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 ICR小鼠耳部痤瘡模型肉眼觀察結(jié)果

圖1顯示，PBS對照組肉眼觀察小鼠耳薄、柔軟，其上毛細(xì)血管清晰可見；模型組造模后耳部出現(xiàn)明顯紅腫，1周后耳廓膿腫更加明顯；四環(huán)素組治療1周后小鼠炎癥明顯減輕，耳廓膿腫、膿皰及丘疹等大部分消退；加減枇杷清肺飲高、中、低劑量組治療后炎癥、膿腫均有不同程度減輕，以高劑量組療效最明顯。

注：a.PBS對照組；b.模型組；c.四環(huán)素組；d.加減枇杷清肺飲低劑量組；e.加減枇杷清肺飲中劑量組；f.加減枇杷清肺飲高劑量組圖1 治療1周后各組ICR小鼠耳部皮膚觀察結(jié)果比較

注：a.PBS對照組；b.模型組；c.四環(huán)素組;d.加減枇杷清肺飲低劑量組；e.加減枇杷清肺飲中劑量組；f.加減枇杷清肺飲高劑量組圖2 各組ICR小鼠耳部組織炎癥改變比較(HE ×200)

3.2 各組ICR小鼠耳部組織病理改變

圖2、3顯示，PBS對照組和四環(huán)素組耳部真皮內(nèi)稀疏單一核細(xì)胞浸潤，真皮上部散在少許皮脂腺腺體；模型組真皮內(nèi)炎癥細(xì)胞彌漫性浸潤，間質(zhì)充血水腫，皮脂腺增生明顯；加減枇杷清肺飲高、中、低劑量組炎癥浸潤、間質(zhì)充血水腫及皮脂腺增生均有減輕，以高劑量組減輕最明顯。

注：a.PBS對照組；b.模型組；c.四環(huán)素組；d.加減枇杷清肺飲低劑量組；e.加減枇杷清肺飲中劑量組；f.加減枇杷清肺飲高劑量組圖3 各組ICR小鼠耳部組織皮脂腺腺體改變比較(HE ×200)

3.3 Real-time PCR檢測結(jié)果

表2顯示，與PBS對照組比較，模型組NLRP3、caspase-1、IL-1β的mRNA水平明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，四環(huán)素組，中藥各劑量組NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA水平均有下降，但只有四環(huán)素組以及加減枇杷清肺飲中、高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 不同組別NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA及蛋白表達(dá)

注：與PBS組比較:*P<0.05； 與模型組比較:#P<0.05

3.4 Western blot檢測結(jié)果

圖4表2顯示，與PBS對照組比較，模型組NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白水平明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，四環(huán)素組、加減枇杷清肺飲各劑量組NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白水平均有下降，但只有四環(huán)素組及加減枇杷清肺飲中、高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：①對照組；②模型組；③四環(huán)素組；④加減枇杷清肺飲低劑量組；⑤加減枇杷清肺飲中劑量組；⑥加減枇杷清肺飲高劑量組圖4 各組ICR小鼠caspase-1、IL-1β、NLRP3蛋白表達(dá)比較

4 討論

尋常痤瘡屬于中醫(yī)“肺風(fēng)粉刺”“粉刺”等范疇。加減枇杷清肺飲是筆者臨床治療痤瘡的常用方，臨床療效較好。枇杷清肺飲源自《醫(yī)宗金鑒·卷六十五》：“肺風(fēng)粉刺肺經(jīng)熱……宜內(nèi)服枇杷清肺飲，枇杷清肺飲：人參、枇杷葉、甘草、黃連、桑白皮、黃柏”[8]。加減枇杷清肺飲中去掉原方中的黃連、黃柏、人參，加入黃芩、梔子、薏苡仁、白花蛇舌草、忍冬藤、連翹、郁金、夏枯草、丹參、山楂、皂角刺。加減枇杷清肺飲緊扣痤瘡發(fā)病中肺經(jīng)熱盛這一主要病機(jī)，以枇杷葉、桑白皮共為君藥清瀉肺熱為主；黃芩、梔子為臣藥，黃芩能清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血，尤善于清肺火及上焦之實(shí)熱；梔子能瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒、消腫止痛，共助君藥清肺之功；以薏苡仁、白花蛇舌草、忍冬藤、連翹、郁金、夏枯草、丹參、山楂、皂角刺等共為佐藥，佐助君臣清熱除濕解毒、活血散結(jié)、排膿消癰，甘草為使調(diào)和諸藥。

尋常痤瘡為多因素所致的炎癥性疾病，痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)為誘發(fā)痤瘡炎癥過程的重要因素，是革蘭氏陽性厭氧菌，是正常皮膚菌群之一，但在痤瘡患者的毛囊皮脂腺中其數(shù)量明顯增加[9]。ICR小鼠耳廓皮內(nèi)注射P.acnes，24 h后耳廓出現(xiàn)嚴(yán)重的紅斑腫脹，表現(xiàn)出典型的炎癥癥狀[10]。痤瘡炎癥是宿主對P.acnes的免疫反應(yīng)，以固有免疫應(yīng)答為其特征。固有免疫系統(tǒng)中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體(NLRs)是一類重要的胞內(nèi)模式識別受體(PRR)，可以識別微生物分子及危險(xiǎn)信號，觸發(fā)炎癥和抗微生物反應(yīng)。NLRP3是NLRs家族成員之一，NLRP3激活后與銜接分子ASC及效應(yīng)分子Pro-Caspase-1形成炎性小體和成熟的Caspase-1，成熟的Caspase-1進(jìn)一步將Pro-IL-1β剪接成成熟的IL-1β，從而引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)及疾病的發(fā)生[6]。已有研究顯示，NLRP3炎性小體參與痤瘡的發(fā)病機(jī)制，痤瘡患者皮損中NLRP3、成熟的Caspase-1及IL-1β均增加；P.acnes在人皮脂腺細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中均能激活NLRP3炎性小體，活化caspase-1，誘導(dǎo)IL-1β分泌；沉默NLRP3或者阻斷caspase-1后，均能抑制IL-1β的分泌；鉀離子外流、ROS生成、細(xì)胞吞噬、溶酶體破裂及蛋白酶表達(dá)等均參與P.acnes刺激的NLRP3激活、Caspase-1成熟及隨之而來IL-1β分泌；抗IL-1β或靶向NLRP3炎性小體成分治療能阻止P.acnes引起的皮膚炎癥反應(yīng)[11-13]。

本研究采用P.acnes誘導(dǎo)的ICR小鼠耳部痤瘡炎癥模型，加減枇杷清肺飲進(jìn)行干預(yù)治療。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NLRP3炎性小體參與了P.acnes誘導(dǎo)的ICR小鼠耳部痤瘡炎癥的形成；加減枇杷清肺飲能減輕痤瘡模型的炎癥，減少皮脂腺增生，降低NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA及蛋白的表達(dá)，說明加減枇杷清肺飲可以有效改善痤瘡的炎癥及皮脂腺增生，抑制NLRP3炎性小體的激活及其下游因子IL-1β分泌可能是其作用機(jī)制。

本研究初步探索了加減枇杷清肺飲對NLRP3、caspase-1、IL-1β的影響，為闡明加減枇杷清肺飲治療痤瘡的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，但痤瘡發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，加之加減枇杷清肺飲成分較多，究竟是方中何種成分起的作用，以及是通過何種途徑抑制NLRP3炎性小體的激活尚不清楚，同時是否還對痤瘡發(fā)病的其他環(huán)節(jié)有干預(yù)作用，均有待進(jìn)一步的研究。