骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修飾治療急性肝功能衰竭的研究進(jìn)展

陳笑艷，王經(jīng)琳，施曉雷

（1.東南大學(xué)醫(yī)院 外科，江蘇 南京 210018；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 肝膽外科，江蘇 南京210008）

我國(guó)是肝病高發(fā)國(guó)家，各種肝病引起的急、慢性肝功能衰竭患者病情兇險(xiǎn)、進(jìn)展迅速、預(yù)后較差，內(nèi)科藥物治療病死率高達(dá)50%～80%[1]。急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）是由多種病因?qū)е碌耐话l(fā)、嚴(yán)重的肝損傷，伴有大量肝細(xì)胞功能障礙，可表現(xiàn)為嚴(yán)重的肝性腦病、凝血功能障礙、黃疸和進(jìn)行性多器官功能衰竭。因此，ALF的治療一直是臨床上亟待解決的難題。肝移植是治療ALF最確切的手段，但臨床應(yīng)用受到了供體短缺、手術(shù)費(fèi)用高昂、術(shù)后需要長(zhǎng)期服用免疫抑制劑等原因的限制，臨床上僅有很少一部分患者實(shí)施肝移植治療。干細(xì)胞移植近年來(lái)發(fā)展迅速，因其移植簡(jiǎn)單，對(duì)受體的影響小，價(jià)格相對(duì)較低，成為繼肝移植后又一治療ALF的有效手段[2]。目前，細(xì)胞移植治療ALF的種子細(xì)胞包括肝細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSs）等[3-4]。MSCs因其來(lái)源豐富、增殖能力強(qiáng)、沒(méi)有倫理制約，是細(xì)胞移植中最理想的細(xì)胞來(lái)源[5]。因此，MSCs移植治療ALF成為研究的熱點(diǎn)[6]。MSCs通過(guò)免疫調(diào)節(jié)可以促血管生成[7]、抗凋亡[8]和抗氧化[9]。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs在肝衰竭、肝纖維化、肝硬化等肝臟疾病的治療具有良好的效果[10]。

雖然干細(xì)胞療法已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但針對(duì)這些臨床研究的系統(tǒng)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)：目前已有的干細(xì)胞移植僅能改善患者部分肝功能指標(biāo)，并且對(duì)于患者的生存期并無(wú)顯著影響[11]。在MSCs移植過(guò)程中，由于移植干細(xì)胞對(duì)損傷部位的嚴(yán)重氧化和炎癥應(yīng)激的抵抗力不足造成只有少數(shù)細(xì)胞可以遷移到受損組織，移植后低細(xì)胞存活率顯著降低了其治療效果[12]。盡管目前MSCs的優(yōu)勢(shì)使其在再生領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，但如何將足夠量的MSCs有效的遞送到受損組織，這一過(guò)程仍存在相當(dāng)多的挑戰(zhàn)，限制了MSCs真正的臨床應(yīng)用，阻礙了MSCs移植治療從實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入臨床研究。

1 MSCs的治療缺點(diǎn)

MSCs存在于體內(nèi)低氧張力（即1%～5% O2）的微環(huán)境中，而一般培養(yǎng)環(huán)境（即20%～21% O2）的氧濃度，高于其原始生存環(huán)境[13-14]，因此，一旦將MSCs從原始組織中分離出來(lái)并誘導(dǎo)其在體外增殖，周圍環(huán)境不足以維持其自我更新和分化的能力。隨著周圍微環(huán)境的改變，MSCs在分離和體外培養(yǎng)后將失去一部分功能。不僅如此，在各種疾病的病理狀態(tài)下，MSCs自我更新和分化的能力降低，這限制了細(xì)胞資源的基本應(yīng)用。體內(nèi)移植后，特殊的病理環(huán)境顯著降低了MSCs的自我更新能力和存活率。因此，盡管培養(yǎng)的MSCs被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞移植，但低存活率和高凋亡率降低了其治療效果。因此，如何增加細(xì)胞定向遷移的數(shù)量是干細(xì)胞移植的關(guān)鍵因素[15]。

針對(duì)這一問(wèn)題，研究發(fā)現(xiàn)在其應(yīng)用前對(duì)缺氧、藥理學(xué)、化學(xué)制劑、營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞因子和物理因子進(jìn)行預(yù)處理能夠激活生存信號(hào)，以對(duì)抗MSCs移植應(yīng)用的微環(huán)境。最近研究表明，經(jīng)過(guò)預(yù)處理的MSCs能顯著提高細(xì)胞存活率，增加分化效果，促進(jìn)旁分泌作用，提高損傷部位的修復(fù)能力[16-18]。預(yù)處理、基因修飾和MSCs培養(yǎng)條件的優(yōu)化是提高M(jìn)SCs在體內(nèi)定值能力和體內(nèi)發(fā)揮功能的關(guān)鍵，有助于提高組織工程和再生醫(yī)學(xué)的MSC移植效果[16]。對(duì)MSCs進(jìn)行預(yù)處理，基因修飾或使用生物材料包被后的移植為提高M(jìn)SCs的存活率，促進(jìn)其神經(jīng)源性、血管生成性和免疫調(diào)節(jié)特性開(kāi)辟了新的途徑。Tang等[19]發(fā)現(xiàn)MSCs與褪黑素、Liu等[20]發(fā)現(xiàn)血管緊張素II、Li等[21]發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀的預(yù)處理技術(shù)分別顯示增強(qiáng)了腦缺血和心肌梗死的干細(xì)胞治療。因此，研究更有效的途徑來(lái)改善MSCs對(duì)ALF治療效果是非常必要的。

2 MS C s的預(yù)處理

MSCs預(yù)處理的主要方法有：使用生物材料包被后移植、缺氧預(yù)處理、使用細(xì)胞因子預(yù)處理干細(xì)胞以提高其對(duì)惡劣環(huán)境的耐受性、改善干細(xì)胞移植區(qū)域的微環(huán)境和選用適當(dāng)?shù)幕驅(qū)Ω杉?xì)胞進(jìn)行修飾等。

2.1 使用生物材料包被

2.1.1 膠原凝膠復(fù)合MSCs：采用膠原凝膠復(fù)合間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝功能衰竭患者。膠原凝膠是水凝膠的一種，具有水凝膠的特性，可以形成立體三維網(wǎng)狀支架，同時(shí)膠原蛋白作為天然的細(xì)胞外基質(zhì)，它具有無(wú)毒、低免疫原性和可降解性的優(yōu)點(diǎn)[4，11，15]。膠原是一種天然來(lái)源的高分子蛋白質(zhì)，具有來(lái)源方便、體內(nèi)可降解和低免疫原性等優(yōu)勢(shì)。膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成份，具有良好的生物相容性，被認(rèn)為是理想的生物材料。它不僅為細(xì)胞的靶向遞送提供載體，同時(shí)又為細(xì)胞粘附和組織三維重建提供支架作用，因此，可以提高移植細(xì)胞的運(yùn)輸效率，并且可以在體內(nèi)提供移植細(xì)胞的生存空間，進(jìn)而可以改善被移植細(xì)胞的存活率，并有助于在一定程度上解決單純的干細(xì)胞移植所存在的滯留率和存活率低而限制了治療效果的問(wèn)題[22]。用生物材料承載干細(xì)胞可提升干細(xì)胞的治療效應(yīng)已得到廣泛確認(rèn)[23-24]。

2.1.2 細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）：ECM是由動(dòng)物細(xì)胞合成并在細(xì)胞外分泌的大分子，其分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間，主要是多糖和蛋白質(zhì)，或蛋白多糖。這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持和連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織發(fā)育和細(xì)胞生理活動(dòng)。ECM是微環(huán)境的重要組成部分，為維持細(xì)胞功能提供重要的生化與物理信號(hào)。該研究模擬了使用細(xì)胞外基質(zhì)系統(tǒng)在體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞所需的三維微環(huán)境[25-26]，通過(guò)這種方式，獲得具有臨床級(jí)數(shù)量和“干性”維持能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.1.3 GFc7：這是一種納米螯合基納米復(fù)合材料，它可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，表達(dá)多能性基因和自導(dǎo)標(biāo)記和抗氧化防御；自發(fā)的分化相關(guān)基因被抑制，而決定細(xì)胞命運(yùn)的特定的分化相關(guān)基因的方向顯著上調(diào)[27]，進(jìn)而能夠提高M(jìn)SCs的移植治療效果。

2.2 缺氧預(yù)處理

O2對(duì)于細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，因?yàn)槿毖跏且恍└甙l(fā)病率和高死亡率疾病的主要發(fā)病機(jī)制[28]。在缺氧條件下的預(yù)處理MSCs，如H2O2（氧化應(yīng)激）和特殊細(xì)胞因子預(yù)處理是近年來(lái)提高M(jìn)SCs生存率和潛能的常用策略[29]。對(duì)MSCs進(jìn)行缺氧預(yù)處理包括先2.5% O2培養(yǎng)15 min，21% O2再氧化30 min，72 h的缺氧預(yù)處理可以顯著提高M(jìn)SCs在體外增殖和遷移的能力[30]，缺氧會(huì)降低MSCs的細(xì)胞活性和增殖，但復(fù)氧的這一過(guò)程會(huì)促進(jìn)MSCs的恢復(fù)，進(jìn)而提高其細(xì)胞活性。研究者證實(shí)缺氧和復(fù)氧還能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的MSCs的多效性[30-31]。缺氧預(yù)處理可以提高遺傳穩(wěn)定性和染色體穩(wěn)定性，并確保MSCs在體外的安全性[32]。有證據(jù)表明，缺氧預(yù)處理MSCs的移植可以通過(guò)上調(diào)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的分泌來(lái)增強(qiáng)治療效果[33-34]?？紤]到缺氧和復(fù)氧的優(yōu)點(diǎn)，目前的研究主要集中在優(yōu)化氧濃度，從而改善MSCs的細(xì)胞活性和治療效果。雖然研究證實(shí)缺氧是MSCs在體外和體內(nèi)的保護(hù)性因素，但仍有必要確定最佳氧濃度，以提高M(jìn)SCs的存活率和治療效果。

2.3 使用細(xì)胞因子對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理

2.3.1 pHGF與MSCs聯(lián)合治療：促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素（promoting hepatocyte growth factor，pHGF）是從乳豬新鮮肝臟中提取純化的一種小分子多肽類活性物質(zhì)，一定濃度的pHGF可以提高細(xì)胞抗氧化的能力，從而達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡和壞死的作用。其對(duì)穩(wěn)定受損肝組織的環(huán)境，保護(hù)肝細(xì)胞，加速肝臟修復(fù)有一定的作用。pHGF對(duì)CCL4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷有良好的保護(hù)作用。該研究發(fā)現(xiàn)，pHGF與MSCs的組合可以更有效地下調(diào)ALF大鼠的全身炎癥反應(yīng)，從而減輕肝損傷，改善肝壞死，降低轉(zhuǎn)氨酶水平[35]?？偠灾琾HGF與MSCs在ALF大鼠模型治療中的組合優(yōu)于單獨(dú)使用MSCs或pHGF，這可能與pHGF誘導(dǎo)的ALF大鼠模型肝臟中MSCs細(xì)胞數(shù)增加有關(guān)。

2.3.2 ZD和穩(wěn)定的miR-210為基礎(chǔ)進(jìn)行預(yù)處理：miR-210的精確調(diào)控對(duì)于ALF的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持和移植效能的增強(qiáng)至關(guān)重要。在目前的研究中，我們證明了一種小分子zeaxanthin dipalmitate（ZD）可以增強(qiáng)人體脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞（hAD-MSCs）在體外的抗應(yīng)激能力，并提高其在體內(nèi)移植后治療ALF的效果[36]。ZD處理顯著促進(jìn)細(xì)胞存活并通過(guò)PKC/raf1/MAPK/NF-kappa B通路，抑制細(xì)胞凋亡、炎癥和活性氧（ROS）的產(chǎn)生，維持了miR-210的高表達(dá)水平?；赯D和穩(wěn)定的miR-210的預(yù)處理，顯著提高了干細(xì)胞移植的療效，提高其抗氧化水平，并顯著提高了移植治療后肝臟組織的修復(fù)能力。維持miR-210的生理水平對(duì)hAD-MSC的體內(nèi)平衡至關(guān)重要[36]。

2.4 改善干細(xì)胞移植區(qū)的微環(huán)境

基于干細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用的主要問(wèn)題之一是由于損傷組織的氧化應(yīng)激和炎癥環(huán)境導(dǎo)致的低細(xì)胞存活率。迄今為止，包括NAC、edaravone和褪黑素在內(nèi)的幾種抗氧化劑，通過(guò)增強(qiáng)抵抗氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡和其他應(yīng)激源[37-39]的內(nèi)源性防御能力，可以安全增強(qiáng)移植效果。

2.5 使用適當(dāng)?shù)幕蛐揎椄杉?xì)胞

MSCs不僅易于被基因載體所轉(zhuǎn)染或感染，亦能穩(wěn)定高效地表達(dá)特定的外源目的基因，因此MSCs是用于在基因治療期間攜帶治療基因的種子細(xì)胞的理想選擇[40]，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以提高M(jìn)SCs在體內(nèi)的功效，它可以通過(guò)分泌因子減少其在缺氧和炎癥環(huán)境中的細(xì)胞凋亡，并增加其對(duì)受損組織的定植率和分化成特定組織的能力。

Zheng等[41]將白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑（IL-1Ra，具有抗炎和抗凋亡作用）轉(zhuǎn)染到MSCs中，將高表達(dá)IL-1Ra的MSC移植入ALF大鼠后，與其他組相比，肝損傷、炎癥因子（IL-1β、IL-6）和死亡率顯著下降，并且MSCs在肝臟的定植率顯著上升。Xiao等[42]使用殼聚糖納米粒和IL-1Ra制備緩釋結(jié)構(gòu)，通過(guò)與MSCs共同移植到ALF豬中，肝細(xì)胞增殖水平和肝功能得到顯著改善。Ma等[43]發(fā)現(xiàn)MSCs移植對(duì)ALF的定植率較低，而CXCR4轉(zhuǎn)染的MSCs的定植率顯著增加，促進(jìn)了肝細(xì)胞的增殖和功能恢復(fù)。

2.6 化學(xué)修飾

由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)影響MSCs的特征，因此在細(xì)胞移植之前用藥物預(yù)處理MSCs，它可以提高M(jìn)SCs在炎癥環(huán)境中的存活率和修復(fù)受損組織的能力。

2.6.1 自噬調(diào)節(jié)的MSCs：研究人員已經(jīng)推出了一種新的策略，以增強(qiáng)基于MSCs的肝臟疾病，特別是ALF的細(xì)胞療法。在短時(shí)間內(nèi)，自噬調(diào)節(jié)的MSCs更有可能通過(guò)旁分泌的作用促進(jìn)肝再生。進(jìn)一步的研究，包括在MSCs擴(kuò)展過(guò)程中對(duì)ATG7表達(dá)的評(píng)價(jià)，它對(duì)移植后的動(dòng)物模型中MSCs的存活和追蹤產(chǎn)生影響。MSCs的自噬抑制可以改善其肝再生潛能，并可作為改善ALF細(xì)胞治療的新策略[44]。

2.6.2 氟西汀預(yù)處理的MSCs：氟西汀增強(qiáng)MSCs的存活和它們對(duì)MSCs的旁分泌特性。此外，氟西汀預(yù)處理的MSC組顯示了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derive neurotrophic factor，BDNF）和血管生成因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA的表達(dá)顯著升高改善了MSCs旁分泌的特性[45]。氟西汀對(duì)MSCs的預(yù)處理提高了它們的生存、旁分泌和免疫調(diào)節(jié)特性，并直接影響了神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)。

2.6.3 中草藥對(duì)MSCs的保護(hù)：研究發(fā)現(xiàn)某些中藥可以用于保護(hù)MSCs，使其免受傷害，并增加MSCs在體外的分化含量。黃芪甲苷可以抵抗氧化性鏈球菌的損傷，通過(guò)降低NF-kB p65的易位，以及增加MMP-2表達(dá)[46]，能夠促進(jìn)MSCs增殖，并抑制MSCs中Toll樣受體4 （Toll-like receptor 4，TLR4）的高糖誘導(dǎo)表達(dá)。

2.7 骨髓聯(lián)合移植

1978年Schofield[47]首先提出了龕（niche）的概念，造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）固定于微環(huán)境中。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，骨髓微環(huán)境是一個(gè)三維結(jié)構(gòu)環(huán)境，是體內(nèi)容納干細(xì)胞生存并調(diào)控其自我更新、分化發(fā)育、歸巢定位的細(xì)胞微環(huán)境，它主要包括基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和各種細(xì)胞因子。HSCs和MSCs是存在于其中的兩類干細(xì)胞。Urban等[48]在1型糖尿病的動(dòng)物模型中將MSCs和骨髓細(xì)胞（bone marrow cells，BMCs）共同移植到糖尿病小鼠體內(nèi)時(shí)發(fā)現(xiàn)血糖及胰島素水平可以恢復(fù)到正常水平，但是單一移植則沒(méi)能夠達(dá)到相同的效果。MSCs和BMCs協(xié)同誘導(dǎo)受體來(lái)源的胰腺胰島素分泌細(xì)胞再生。其次，MSCs可以抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)新生細(xì)胞的免疫反應(yīng)。Moioli等[49]也發(fā)現(xiàn)在骨損傷后的血管形成過(guò)程中，聯(lián)合移植MSCs和HSCs，血管數(shù)量和直徑較單獨(dú)移植MSCs時(shí)顯著增加，聯(lián)合移植促進(jìn)組織血管化和再生。在骨組織、肌肉組織及真皮組織等依賴血管形成的損傷修復(fù)及內(nèi)臟組織再生中，HSCs有協(xié)同MSCs的作用。MSCs與其周圍的微環(huán)境一起移植到肝臟，在肝臟的新的微環(huán)境中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可能會(huì)發(fā)揮更好的修復(fù)損傷肝組織的作用，為臨床治療ALF提供新的思路和方法。

3 結(jié)語(yǔ)

MSCs已被證明可以保護(hù)組織和器官免受外部傷害，然而研究發(fā)現(xiàn)，MSCs一旦離開(kāi)原始組織并在體外誘導(dǎo)增殖，周圍微環(huán)境的變化就不足以維持其分化和自我更新。隨著微環(huán)境的改變，會(huì)導(dǎo)致體外培養(yǎng)的MSCs喪失部分生物學(xué)功能。此外，在移植過(guò)程中，只有少數(shù)細(xì)胞能夠遷移到受損的組織中，移植后的低細(xì)胞存活率顯著降低了其治療效果。因此，盡管近年來(lái)MSCs細(xì)胞移植得到迅速發(fā)展，但是仍然有相當(dāng)多的挑戰(zhàn)限制了MSCs真正的臨床應(yīng)用，仍有必要研究更有效的途徑來(lái)改善其治療效果。MSC修飾或MSCs與其他治療方法的結(jié)合也越來(lái)越受到重視，培養(yǎng)條件的預(yù)處理、遺傳修飾和優(yōu)化是提高M(jìn)SCs體外和體內(nèi)功能的關(guān)鍵策略，所有這些步驟都有助于提高M(jìn)SCs移植在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的效能，但是還應(yīng)該對(duì)MSCs修飾的具體機(jī)制進(jìn)行更多的研究，進(jìn)一步闡明相關(guān)修飾是如何影響移植到體內(nèi)的MSCs的生物學(xué)活性，進(jìn)而使得MSCs的治療可以得到更廣泛的應(yīng)用，并從實(shí)驗(yàn)室研究中推動(dòng)MSCs移植進(jìn)入臨床研究階段。