肺纖維化發(fā)病機制的研究進展

孫佳 張廣平 李晗 葉祖光

1遼寧師范大學生命科學學院，大連116000；2中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京100075

肺纖維化是以肺間質(zhì)彌漫性滲出、浸潤和纖維化為主要病變的疾病，其基本形成過程包含肺組織的炎性損傷、炎癥細胞的移動、炎癥介質(zhì)的釋放、損傷的調(diào)整及結(jié)構(gòu)修復停滯等緣由而引發(fā)的纖維化及瘢痕，病變部位首先涉及肺間質(zhì)、肺泡上皮細胞和肺血管。肺纖維化是間質(zhì)性肺疾病，其病理學的特點為肺泡上皮細胞損傷和增殖、基底膜剝蝕、肺泡實變和成纖維細胞病變，最后患者出現(xiàn)進行性呼吸困難、咳嗽、呼吸生理機能受限及氣體交換障礙等癥狀[1]。炎癥細胞、細胞因子、肌成纖維細胞、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)、蛋白酶系統(tǒng)、脂質(zhì)過氧化作用以及信號轉(zhuǎn)導機制等在纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性作用[2]。由于其病因復雜，發(fā)病機制尚不明確，臨床上傳統(tǒng)的治療方法存在很多不足，特別是在肺纖維化的中期和晚期時治療效果欠佳，病死率較高，因此急需大量的實驗方法用于研究該病的發(fā)病機制，有助于為臨床治療提供較好的實驗依據(jù)[3-4]。

1 特異性因子

肺纖維化病變產(chǎn)生的炎癥細胞可直接生成特異性因子，它們也可通過肺上皮細胞、內(nèi)皮細胞及間質(zhì)細胞間接表達生成。研究表明，一種細胞可分泌合成多種細胞因子，不同種類細胞因子相互作用、互相影響，構(gòu)成復雜的肺細胞因子網(wǎng)絡(luò)。一些細胞除了形成細胞因子外還存在細胞凋亡，細胞凋亡在肺炎癥、纖維化的發(fā)生中也起到了重要的作用[5]。比如：在初期病變時，肺巨噬細胞凋亡有利于消除炎癥、清除受損細胞、重新構(gòu)建肺部結(jié)構(gòu)以及保持肺功能；但在晚期隨著巨噬細胞大量凋亡，又對機體產(chǎn)生損害作用。

1.1 轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1) TGF-β1主要由巨噬細胞、肺上皮細胞、成纖維細胞、嗜酸粒細胞分泌，是導致肺纖維化的關(guān)鍵性細胞因子，可促進細胞增殖、分化、黏附、修復和基質(zhì)形成，誘導肺成纖維細胞生成，刺激成纖維細胞合成大量膠原。TGF-β1是如今發(fā)現(xiàn)的促使細胞外基質(zhì)沉積最強的因子，其生物學作用是通過它的信號轉(zhuǎn)導途徑來完成的，TGF-β1細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑需要細胞質(zhì)內(nèi)Smad蛋白家族的共同參與[6]，并且其能誘導間質(zhì)細胞中細胞外基質(zhì)的蛋白表達[7-8]。TGF-β1可以促進腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、血小板衍生生長因子 (platelet derived growth factor，PDGF)的產(chǎn)生，但是研究顯示其不足以引起永久性肺纖維化。

1.2 TNF-α TNF-α是在炎癥因子刺激下，機體組織產(chǎn)生的細胞免疫預(yù)防因子。它能引起炎癥反應(yīng)以及間質(zhì)細胞的增殖分化；可以引發(fā)腫瘤出血，進一步殺傷體外培育的腫瘤細胞；同時也能促進內(nèi)皮細胞形成黏附分子，進而加強與白細胞的黏附。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α能促進中性粒細胞的聚集，激活間質(zhì)組織釋放蛋白水解酶。樊茂蓉等[9]認為TNF-α可刺激其他炎癥因子的表達，加強炎癥反應(yīng)，使成纖維細胞增殖，纖維母細胞合成膠原増加，直接或間接地促進細胞外基質(zhì)的合成。在肺纖維化模型中發(fā)現(xiàn)肺部有TNF-α大量合成，并且TNF-α基因轉(zhuǎn)錄水平高于正常肺組織[10]，TNF-α大量合成可以促進肺纖維化的形成。

1.3 IL IL是一種細胞因子，與其受體相結(jié)合后激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮作用。IL-1由單核巨噬細胞形成，可以直接或間接促進細胞因子的形成，并且影響肺纖維化，它能使黏附分子分泌增多，使白細胞進入肺間質(zhì)，促使肺成纖維細胞生成膠原和氨基多糖，引發(fā)間質(zhì)性肺纖維化。IL-4在早期炎癥反應(yīng)時能夠抑制T淋巴細胞的產(chǎn)生，在晚期炎癥反應(yīng)時可以促進肺纖維化的形成[11]。IL-6可通過JAK-STAT途徑誘導膠原的產(chǎn)生，抑制膠原的降解。IL-7可以經(jīng)過Smad7抑制TGF-β形成膠原。IL-8對血管增生和細胞外基質(zhì)沉積有一定程度的促進作用[12]。IL-10在快速炎癥反應(yīng)時，可以通過減少TGF-β的表達，降低膠原的沉積；在纖維化的后期，它可通過上調(diào)TGF-β的表達，促進肺纖維化。IL-12和IL-13既可以減輕肺部炎癥的形成，同時也能減輕纖維化的形成。

1.4 內(nèi)皮素 (endothelin，ET) ET是由21種氨基酸組成的多肽，具有3種同分異構(gòu)體，分別為ET-1、ET-2、ET-3[5]。它能促進血管收縮，同時還可以促進成纖維細胞和內(nèi)皮細胞DNA的合成，并進一步增加成纖維細胞。

1.5 PDGF PDGF是由A、B 2條鏈構(gòu)成，有AA、BB、AB 3種構(gòu)造。PDGF通過自分泌和旁分泌的形式發(fā)揮作用。PDGF通過促進成纖維細胞的增殖導致肺纖維化，當器官受損時，巨噬細胞和血小板等大量分泌PDGF，導致細胞增殖，炎癥反應(yīng)加重，這是肺纖維化形成的主要原因[10]。

1.6 結(jié)締組織生長因子 (connective tissue growth factor，CTGF) CTGF是1991年Bradham等[13]在臍靜脈內(nèi)皮細胞發(fā)現(xiàn)的，它由349個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為34 000～38 000，是富含半胱氨酸的分泌肽。CTGF能刺激Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白的合成，促使細胞外基質(zhì)沉積。CTGF能引發(fā)成纖維細胞有絲分裂，進一步促使成纖維細胞的形成。研究發(fā)現(xiàn)，CTGF和TGF-β1的表達呈明顯正相關(guān)，可以導致肺纖維化的形成。實驗證明，CTGF可以促進細胞遷移、增殖、分化，并且在其他疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中也有一定的影響[14]。

1.7 γ-干擾素 (interferon-γ，IFN-γ) IFN-γ是一種重要的抑制肺纖維化形成的功能因子。研究發(fā)現(xiàn)，在肺損傷早期IFN-γ表達增高，它可以抑制膠原的產(chǎn)生，同時還可以促進膠原的降解，進而抑制肺纖維化的形成。IFN-γ經(jīng)過調(diào)整TGF-β的作用影響肺纖維化，在某種條件下，IFN-γ相當于競爭性抑制劑，它的信號傳導蛋白與細胞內(nèi)Smad-7連接，競爭性抑制TGF-β信號傳導通路，進一步阻斷合成膠原蛋白的信號[15]。

1.8 黏附分子 黏附分子由細胞形成并黏附于細胞表面，可增加細胞與細胞之間或細胞與基質(zhì)之間的相互作用，細胞黏附分子在許多生理或病理中都有很重要的作用，包括細胞的信號傳導、生長、分化、炎癥與創(chuàng)傷愈合等。在肺纖維化的初期，黏附分子經(jīng)由黏附作用活化和趨化炎癥細胞，傳遞信息，釋放蛋白酶和活性氧，使內(nèi)皮細胞和基底膜受損，各種細胞因子和生長因子進入肺間質(zhì)可以引發(fā)細胞增殖和基質(zhì)的增加。實驗證明，博來霉素致肺纖維化大鼠肺泡上皮細胞、肺泡巨噬細胞、肺血管內(nèi)皮細胞黏附分子的表達明顯增強，證明在肺間質(zhì)細胞增殖以及細胞外基質(zhì)蛋白的形成過程中黏附分子發(fā)揮了一定的作用[16]。

1.9 趨化因子 趨化因子是趨化白細胞作用的因子，主要包含單核細胞趨化蛋白3、單核細胞趨化蛋白1、干擾素誘生蛋白10等。趨化因子能誘導炎性細胞的趨化、活化、細胞因子的調(diào)整、黏附分子的表達和單核細胞的分化。實驗發(fā)現(xiàn)，博來霉素造模大鼠中趨化因子在0～20 d顯著上升，表明趨化因子有可能參與肺纖維化的早期病變[17]。

1.10 核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB) NF-κB是調(diào)控炎癥反應(yīng)的主要因子。在靜息的狀態(tài)下，NF-κB與它的抑制劑IκB結(jié)合，NF-κB無活性。IκB磷酸化使NF-κB激活，引起一系列級聯(lián)放大反應(yīng)而調(diào)整基因轉(zhuǎn)錄，因此抑制NF-κB的活性對肺纖維化的大鼠有保護作用[18-19]。TNF-α基因的啟動子可以與NF-κB結(jié)合，因此在肺纖維化中NF-κB的表達受TNF-α調(diào)控。在博來霉素致肺纖維化模型中大量炎性基因表達，NF-κB作為多功能核轉(zhuǎn)錄因子，能夠促進多種細胞因子、黏附分子和趨化因子的基因轉(zhuǎn)錄，進而形成肺泡炎和肺纖維化。

2 肌成纖維細胞

肌成纖維細胞可以形成和分泌細胞外基質(zhì)，是肺纖維化形成過程中細胞外基質(zhì)的首要來源。很多細胞因子和信號蛋白參與肌成纖維細胞的分化和轉(zhuǎn)分化過程，其主要是參與α-平滑肌肌動蛋白 (α-smooth muscle action，α-SMA)的表達，由此認為α-SMA是肌成纖維細胞特有的標志蛋白。肌成纖維細胞在PDGF、TGF-β等細胞因子的作用下活化，合成α-SMA蛋白[20]。其中最主要的是通過TGF-β在形態(tài)上刺激肌成纖維細胞的分化，改變纖維組織母細胞，使α-SMA過度表達，引發(fā)膠原合成和細胞外基質(zhì)的過量沉積，組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[21]。

3 EMT在特發(fā)性肺纖維化中的作用

EMT是指圓形的上皮細胞轉(zhuǎn)化為梭形的間質(zhì)細胞，失去上皮細胞的特征，獲得間質(zhì)細胞的特征，并在結(jié)構(gòu)上進行細胞骨架重排，丟失上皮細胞之間黏附性的過程[22-24]。大部分生長因子、激素都可以導致EMT的發(fā)生，如TGF-β、胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子等[25]。EMT在形成肺損傷和肺纖維化的過程中，主要存在于肺泡上皮和氣道上皮，因肺泡上皮是肺纖維化合成的重要參與者，所以EMT可以增加肺纖維化的生成。在肺泡上皮損傷時，肺泡Ⅱ型上皮細胞 (alveolar epithelial cellⅡ，AECⅡ)分裂、脫顆粒轉(zhuǎn)化為AECⅠ，修復受損的上皮細胞[26-27]。在急性肺損傷修復時，AECⅡ也可以轉(zhuǎn)化為AECⅠ，修復肺泡上皮，同時可以減少肺纖維化的合成，完整的肺泡上皮層可以抑制肺成纖維細胞的增生和基質(zhì)的沉淀，然而肺損傷后修復肺泡上皮受阻，也會加強肺纖維化。在慢性肺損傷時，因為致病因素不斷作用，伴隨著AECⅡ增生，影響AECⅠ的轉(zhuǎn)化，導致細胞因子、炎癥趨化因子、細胞黏附分子等的產(chǎn)生，同時也會導致纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)分化，進一步加劇肺纖維化的形成[28]。

4 基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase,MMP)及金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)

MMP為一類同源性很強的內(nèi)肽酶的總稱，TIMP是它特有的組織抑制因子[29]。MMP/TIMP比例的失調(diào)不利于降解肺泡間質(zhì)細胞外基質(zhì)，將會導致細胞外基質(zhì)大量沉積，從而引起肺纖維化[30]。許多MMP的成員與肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展有密切的關(guān)系，如MMP-1、MMP-7。研究發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性肺纖維化早期患者血清和支氣管肺泡灌洗液中MMP-1水平高于健康對照組，并且亞臨床肺間質(zhì)性疾病患者血清和支氣管肺泡灌洗液中MMP-7水平高于健康對照組，肺纖維化時MMP-7的水平更高。這樣就可以看出MMP-1在肺纖維化早期炎性細胞浸潤階段升高，MMP-7主要存在于肺纖維化的基質(zhì)重建中，MMP-7水平的高與低可以直接反映特發(fā)性肺纖維化的嚴重程度[31]。

5 氧化應(yīng)激

生物體的氧化應(yīng)激常與自由基的增加同時存在，通過自由基介導的氧化應(yīng)激是引起氧化損傷的主要原因。氧化應(yīng)激是機體在外界和內(nèi)部氧化作用刺激下所產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)，應(yīng)激反應(yīng)也可以理解為機體通過增加氧消耗來適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境。當肺組織氧化和抗氧化失衡時支氣管表面的活性氧、谷胱甘肽和一氧化氮表達量降低，形成單核細胞和表皮細胞的異常調(diào)節(jié)。在肺纖維化的早期肺泡炎階段，局部肺組織抗氧化劑減少，活化的肺泡巨噬細胞和中性粒細胞產(chǎn)生大量的氧自由基，加強白細胞趨化游走和血管通透性，導致DNA解鏈和細胞膜形成脂質(zhì)過氧化，引發(fā)血管內(nèi)皮細胞受損和炎癥反應(yīng)。血管內(nèi)皮細胞損傷后，細胞基底代謝紊亂，黏附分子過量表達，暴露基底膜，聚集激活血小板，引起凝血。釋放多種活性物質(zhì)，誘導成纖維細胞、平滑肌細胞的增生，合成膠原增加，引起炎癥細胞的趨化和微循環(huán)障礙，加劇肺纖維化的形成[2]。

6 肺纖維化相關(guān)信號轉(zhuǎn)導途徑

6.1 信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化蛋白 (signal transducer and activator of transcription，STAT)信號轉(zhuǎn)導途徑 STAT是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導和表達調(diào)控的蛋白。在博來霉素致肺纖維化1 d后STAT1逐漸增多，7 d后STAT1達到最高值，28 d后STAT1有所下降，但與對照組相比差異仍有統(tǒng)計學意義[32]。有學者認為IFN-γ可以抑制膠原的合成：(1)IFN-γ信號轉(zhuǎn)導蛋白與細胞內(nèi)的Smad7分子結(jié)合，經(jīng)過抑制TGF-β信號轉(zhuǎn)導通路抑制膠原的合成；(2)IFN-γ與受體結(jié)合后，信號進入細胞內(nèi)，細胞核中的轉(zhuǎn)錄蛋白STAT1被激活，競爭性抑制TGF-β的信號轉(zhuǎn)導，可以通過減弱TGF-β的作用抑制膠原的合成[33]。

JAK和STAT功能密切相關(guān)，共同構(gòu)成JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導通路。細胞因子和其受體結(jié)合后可以激活JAK，細胞因子將在受體細胞內(nèi)發(fā)生磷酸化，導致STAT中的SH2磷酸化，STAT進入細胞核中，與DNA的特定位點結(jié)合，調(diào)控基因的表達。大量實驗表明IL-7需要通過JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導途徑抑制TGF-β的表達[34]。

6.2 MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑 許多研究表明，引起肺纖維化的多個因子都可以通過MAPK信號轉(zhuǎn)導通路被激活。Hashimoto等[35]證明了MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑可以誘導人肺成纖維細胞向肌成纖維細胞分化：(1)TGF-β1誘導人肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化存在時間和劑量依賴性；(2)TGF-β1誘導JNK、p38MAPK和ERK磷酸化同時增強活性；(3)CEP-1347、SB203580與PD98059等抑制劑可以減弱TGF-β1激發(fā)的JNK、p38、MAPK與ERK的活性；(4)CEP-1347可以通過劑量依賴效應(yīng)減弱TGF-β1誘導人肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化。說明人肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化時能被TGF-β1誘導，并且JNK在其中起調(diào)控作用。

6.3 TGF-β信號通路與Smad蛋白家族調(diào)控 目前對于TGF-β誘導的細胞外基質(zhì)和膠原沉積的機制尚未明確。很多研究表明環(huán)孢素A拮抗TGF-β是通過直接抑制JunD的活性發(fā)揮作用，而IFN-γ則通過STAT信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮作用。環(huán)孢素A和IFN-γ可抑制TGF-β引起的信號轉(zhuǎn)導，同時抑制膠原沉積，從而達到醫(yī)治肺纖維化的目的。

Smad蛋白家族可以調(diào)控TGF-β信號，Smad2和Smad3是TGF-β上的絲氨酸和蘇氨酸激酶受體下游細胞的靶位點，雖然Smad2和Smad3在TGF-β信號通路上非常重要，但是文獻對其相關(guān)報道較少。Zhao和Geverd[36]對博來霉素致肺纖維化大鼠模型進行研究，發(fā)現(xiàn)在造模3 d后Smad3轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，并在8～12 d持續(xù)下降，但Smad2沒有明顯的變化。進一步觀察TGF-β對Smad3表達的影響時，發(fā)現(xiàn)Smad3蛋白可以從細胞漿直接轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，并且TGF-β能阻止Smad3轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)，所以說明TGF-β信號轉(zhuǎn)導是由負反饋方式來控制的。冀紅[37]研究表明沉默F(xiàn)UT8基因能夠抑制TGF-β/Smad2/3信號轉(zhuǎn)導途徑，同時抑制肌成纖維細胞表型的轉(zhuǎn)化，導致TGF-β/Smad2/3下游的α-SMA、MMP-9和TIMP-1的表達。這些研究為進一步認識肺間質(zhì)纖維化的翻譯和之后的修飾等機制提供了線索，成為治療肺間質(zhì)纖維化的新方法。Gauldie等[38]研究表明在TGF-β/Smad信號通路中Smad7起著非常重要的作用，它可以通過沉默整個信號通路來達到抑制TGF-β的作用。Smad7通過競爭性抑制與細胞膜上TGF-β受體結(jié)合，阻斷TGF-β信號在細胞漿內(nèi)的傳導，使下游信號紊亂引起TGF-β信號轉(zhuǎn)導通路失活[39]。但是Smad7的過表達能恢復TGF-β/Smad通路的平衡，起到抵抗肺纖維化的作用[40]。屈艷等[41]研究表明大黃酸可以提高Smad7的表達，通過上調(diào)Smad7干擾TGF-β/Smad信號通路，最終減少細胞外基質(zhì)的沉積。

6.4 CD40-CD40L系統(tǒng) CD40-CD40L系統(tǒng)是成纖維細胞和其他結(jié)構(gòu)細胞的一個主要活化劑。CD40是TNF-α中的一員，最早認為它存在于B細胞表面。CD40-CD40L在活化的T細胞表面相互作用，可以刺激T細胞產(chǎn)生細胞因子，如IL-4、IL-6和IFN-γ等，還可以刺激B細胞變成漿細胞。CD40L存在于活化的T細胞、活化的肥大細胞和嗜酸粒細胞表面，其主要是在活化的血小板上。所以CD40-CD40L系統(tǒng)可以活化急性肺損傷后產(chǎn)生的血小板和炎癥細胞。CD40-CD40L可以誘導人體成纖維細胞中的前列腺素E2的產(chǎn)生，后者可以促進2型細胞因子IL-5、IL-10的合成，抑制1型細胞因子IFN-γ、IL-12的產(chǎn)生。因此，前列腺素E2可以通過影響1型和2型細胞因子進一步影響肺纖維化[5]。

7 結(jié)語

肺纖維化是一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，患病后治愈率較小，肺的呼吸功能嚴重受損，最終會因呼吸衰竭而死亡。肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展是一個非常復雜的過程，隨著環(huán)境污染增多，引起或加劇氣管炎、肺炎、哮喘等氣管及肺部疾病，最終加大了肺纖維化的發(fā)病率。在肺纖維化的早期涉及到炎癥細胞因子、生長因子、肌成纖維細胞、EMT、MMP/TIMP、氧化應(yīng)激和相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路等。但上述生物標記物在肺纖維化的早期診斷中的敏感度和特異度不是很理想，因此在肺纖維化早期敏感度相關(guān)方面的研究是必要的。同時肺纖維化的發(fā)病機制非常復雜，在分子層次上的研究還較少，因此不同通路的多靶點協(xié)同治療將成為肺纖維化治療的新趨勢。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突