11種樟科樹(shù)枝水提物對(duì)樟芝液體培養(yǎng)的比較

景思佳，張 蕾，劉 洋，張 帆

（1. 浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院生物工程系，浙江 杭州 310023；2.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310023；3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023；4.杭州市園林科學(xué)研究院園林科技科，浙江 杭州 310013）

樟芝Taiwanofungus camphorates 目前自然分布僅在牛樟Cinnamomum kanehirae 腐朽心材內(nèi)壁或枯死倒地的牛樟樹(shù)木材的潮濕表面，為擔(dān)子菌門Basidiomycotina 擔(dān)子菌綱Hymenomycetes 多孔菌目Polyporales 多孔菌科Polyporaceae 臺(tái)芝屬Taiwanofungus[1]，是一種非常珍稀的藥用菌，被稱為“臺(tái)灣森林中的紅寶石”?，F(xiàn)代研究表明樟芝含有包括三萜類化合物、多糖、腺苷等在內(nèi)的豐富的活性物質(zhì)[2]，并證實(shí)其具有解酒護(hù)肝、抗癌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、消炎等作用[3-9]。但因?yàn)橐吧林ドL(zhǎng)條件苛刻，且長(zhǎng)勢(shì)非常緩慢，導(dǎo)致其子實(shí)體價(jià)格不菲且一直供不應(yīng)求。近年來(lái)，生長(zhǎng)周期短、成本低、易于大規(guī)模生產(chǎn)的樟芝液體發(fā)酵[10]是人工培養(yǎng)樟芝的重要方法之一，但是目前仍存在生物活性含量較低的問(wèn)題，所以關(guān)于提高樟芝液體發(fā)酵產(chǎn)物生物活性含量的研究報(bào)道就一直層出不窮。但大多是以生物量、多糖含量及三萜類化合物含量等為檢測(cè)目標(biāo)，對(duì)不同碳源、氮源、碳氮比、微量元素等營(yíng)養(yǎng)條件，初始pH 值、溫度、光照等外界環(huán)境因素以及轉(zhuǎn)速、接種量、溶氧、發(fā)酵周期等液體發(fā)酵條件來(lái)進(jìn)行單因素或正交試驗(yàn)的優(yōu)化。

樟芝是牛樟上發(fā)現(xiàn)唯一的腐木菌，故推測(cè)牛樟樹(shù)中含有促進(jìn)樟芝生長(zhǎng)的某些成分，且因?yàn)檎林ゼ纳≡圆⒉粡?qiáng)，所以牛樟很少因此而死亡，大多都可生長(zhǎng)數(shù)百年[11]。牛樟是樟科Lauraceae 樟屬Cinnamomum 植物，為臺(tái)灣特有的常綠闊葉大喬木，主要分布于臺(tái)灣新竹、臺(tái)東等海拔在200～2 000 m 的山區(qū)。但由于為了獲取椴木來(lái)人工栽培樟芝子實(shí)體等原因，猖獗的人為盜伐，使原本就稀少的牛樟已經(jīng)瀕臨滅絕。與牛樟一樣，樟科的植物大多具有藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，富含揮發(fā)油和脂肪油，并含萜類化合物、生物堿、有機(jī)酸及多糖等成分[12]，是樟腦或樟油的重要原料。通過(guò)添加與牛樟樹(shù)同屬或同科的植物提取物來(lái)優(yōu)化樟芝液體發(fā)酵產(chǎn)物的報(bào)道目前尚無(wú)。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)添加樟腦油（委托安國(guó)中藥加工提取，主要成分為樟腦、桉葉素、黃樟素，經(jīng)檢測(cè)有效含量為99.63%）進(jìn)行液體培養(yǎng)基的優(yōu)化，得到添加0.2 mL 樟腦油的最優(yōu)方案，故本試驗(yàn)挑選11種與牛樟同科同屬或不同屬但在臺(tái)灣有自然分布的樟科植物[13-18]，再與前期的實(shí)驗(yàn)最優(yōu)方案以及無(wú)添加的培養(yǎng)作對(duì)比，來(lái)分析11種樟科植物的提取物對(duì)樟芝液體發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 樟芝菌種，2012年于臺(tái)灣自然科學(xué)博物館引進(jìn)，在浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室采用超低溫保藏法于－80℃冰箱低溫保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基：PDA 39.0 g·L-1，葡萄糖 10.0 g·L-1，瓊脂10.0 g·L-1，pH 自然?；A(chǔ)液體種子培養(yǎng)基：PDB 24.0 g·L-1，葡萄糖 10.0 g·L-1，pH 自然。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：PDB 24.0 g·L-1，葡萄糖 10.0 g·L-1，pH 自然。

1.1.3 樟科植物 黃樟C.parthenoxylon，華南桂C.austrosinense，樟C.camphora，香桂C.subavenium，銀木C.septentrionale，猴樟C.bodinieri，蘭嶼肉桂C.kotoense，浙江樟C.chekiangense，山橿Lindera reflexa，天竺桂C.japonicum，新木姜子Neolitsea aurata 均取自杭州植物園。

表1 牛樟與本試驗(yàn)11種樟科植物的情況Table 1 the situation of C.kanehirae and the 11 species of Lauraceae plants in this study

1.1.4 試劑 PDA、PDB、樟腦油、95%乙醇、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、高氯酸、冰醋酸、香蘭素、香草醛、二氯甲烷、濃硫酸、蒽酮，均購(gòu)自浙江常青化工有限公司，其中試劑類為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.1.5 主要儀器 分析天平，美國(guó)PTX 公司；UV-5500PC 紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司；冷凍干燥儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；高效液相色譜儀，美國(guó)waters 公司；無(wú)菌操作臺(tái)，蘇州佳寶凈化工程設(shè)計(jì)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樹(shù)枝采集 于2015年10 月在杭州植物園采集11種樟科植物的樹(shù)枝，由于樟芝僅生長(zhǎng)在牛樟樹(shù)腐朽的心材內(nèi)壁或枯死倒地的牛樟木的陰暗潮濕面，故使用高枝剪剪取每種同一株樹(shù)5年生以上的老枝，粉碎后得到的樹(shù)枝質(zhì)量均大于100.0 g。

1.2.2 提取物制備 分別將11種樟科植物放入50℃下烘干至恒質(zhì)量后，再分別粉碎、研磨成粉末過(guò)100 目篩后稱質(zhì)量。分別將100.0 g 樹(shù)枝粉末以1:10 的比例放入去離子水中，煮沸1 h，過(guò)濾，再將濾渣以1:8 的比例加入去離子水煮沸1 h，過(guò)濾后將兩次濾液合并，旋蒸濃縮后，保存在4℃的冰箱內(nèi)備用。

1.2.3 分組

對(duì)照組 A：基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基加菌種培養(yǎng)的樟芝菌絲體。

實(shí)驗(yàn)組 B1：在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加黃樟水提物加菌種培養(yǎng)的樟芝菌絲體；B2：在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加華南桂水提物加菌種培養(yǎng)的樟芝菌絲體，B3：在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加樟水提物加菌種培養(yǎng)的樟芝菌絲體；B4：在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加山橿水提物加菌種培養(yǎng)的樟芝菌絲體；B5：在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加香桂水提物加菌種培養(yǎng)的樟芝菌絲體；B6：在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加銀木水提物加菌種培養(yǎng)的樟芝菌絲體；B7：在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加猴樟水提物加菌種培養(yǎng)的樟芝菌絲體；B8：在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加蘭嶼肉桂水提物加菌種培養(yǎng)的樟芝菌絲體；B9：在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加浙江樟水提物加菌種培養(yǎng)的樟芝菌絲體；B10：在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加天竺桂水提物加菌種培養(yǎng)的樟芝菌絲體；B11：在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加新木姜子水提物加菌種培養(yǎng)的樟芝菌絲體；B12：前期實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化培養(yǎng)方案，即在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加0.2 mL 樟腦油培養(yǎng)的樟芝菌絲體。

1.2.4 菌株培養(yǎng)

（1）活化菌株 采用菌種活化培養(yǎng)基對(duì)低溫保存的菌株進(jìn)行活化。配制菌種活化培養(yǎng)基，在121℃，0.1 MPa條件下滅菌20 min，自然冷卻至室溫，將菌株在無(wú)菌條件下接入培養(yǎng)基后，放入28℃人工智能氣候箱，無(wú)光培養(yǎng)15 d，保存于－4℃冰箱備用。

（2）液體菌種培養(yǎng) 配制液體種子培養(yǎng)基，在250 mL 錐形瓶中，加入100 mL 的種子培養(yǎng)基，然后分別添加1 mL 的11種樟科植物的水提物及0.2 mL 的樟腦油，在121℃，0.1 MPa 條件下滅菌20 min，取出培養(yǎng)基，自然冷卻至室溫；在無(wú)菌條件下每瓶接入2 粒（2 cm×1 cm）活化好的菌種，封口。在120 r·min-1，28℃的條件下震蕩培養(yǎng)4d。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，對(duì)照為種子培養(yǎng)基加菌種培養(yǎng)。

（3）液體發(fā)酵培養(yǎng) 配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在250.0 mL 錐形瓶中，加入100.0 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基，然后分別添加1 mL 的11種樟科植物的水提物及0.2 mL 的樟腦油，在121℃，0.1 MPa 條件下滅菌20 min，取出培養(yǎng)基，自然冷卻至室溫；在無(wú)菌條件下把培養(yǎng)4 d 后的液體種子培養(yǎng)基按10%的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，在120 r·min-1，28℃的條件下震蕩培養(yǎng)4 d。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，對(duì)照為及0.2 mL 的樟腦油。

1.2.5 生物量測(cè)定 取A，B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12的發(fā)酵液，用3 層200 目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，得到菌絲體，用蒸餾水沖洗菌絲體3 次后，置于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥后，研磨成粉，分別測(cè)定樟芝菌絲體粉末的干質(zhì)量，放于干燥皿中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 總?cè)坪繙y(cè)定 取前期儲(chǔ)存?zhèn)溆玫腁，B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12的菌絲體粉末各0.2 g，測(cè)定總?cè)频暮?。參照陸震鳴等[19]的方法，以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-冰乙酸顯色法測(cè)定。測(cè)定前，采用紫外分光光度計(jì)于400～700 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示在550 nm 處具有最大吸光值，所以該反應(yīng)的吸收波長(zhǎng)設(shè)定為550 nm。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精確稱取齊墩果酸10.0 mg，置于50.0 mL 容量瓶，加二氯甲烷定容至刻度，配制成濃度為0.2 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確量取濃度為0.2 mg·mL-1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，分別放入具塞磨口試管中，加熱去除溶劑，然后各加入0.3 mL 的5%香草醛-冰醋酸溶液和及1 mL 高氯酸，加塞。于60℃恒溫水浴20 min，取出后立即用冰水冷卻，再分別加入5.0 mL 冰醋酸，在漩渦混合器混合均勻，在550 nm 處測(cè)定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，齊墩果酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液及總?cè)茰y(cè)定：取樟芝菌絲體粉末0.1 g 于10 mL 的蒸餾水中，于100℃水浴回流2 h，冷卻后以1:4 的比例加入無(wú)水乙醇，置于4℃沉淀過(guò)夜，抽濾，取其濾液各1.0 mL，置于3個(gè)磨口試管中，加熱蒸干溶劑，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定吸光度值，計(jì)算不同培養(yǎng)基樟芝菌絲體中總?cè)坪縖20]。

1.2.7 多糖含量測(cè)定 取A，B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12的菌絲體粉末，測(cè)定多糖含量。參照《中國(guó)藥典》的方法[21]，以無(wú)水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用蒽酮-硫酸法法測(cè)定。測(cè)定前，采用紫外分光光度計(jì)于400～800 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示在620 nm 處具有最大吸光值，所以該反應(yīng)的吸收波長(zhǎng)設(shè)定為620 nm。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精確稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100.0 mg 定容于1 000.0 mL，配制成濃度為0.1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確吸取0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.4 mL，0.5 mL，0.6 mL，分別放入具塞磨口試管中，分別加蒸餾水至1.0 mL，各加5.0 mL 蒽酮試劑，震蕩混勻，置于水浴20 min，取出冷卻至室溫，在620 nm 處測(cè)定吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液及胞內(nèi)多糖測(cè)定：取樟芝菌絲體粉末0.2 g 于20.0 mL 的蒸餾水中，于80℃水浴加熱2 h，冷卻，然后加入1:4 體積的無(wú)水乙醇混勻，置于4℃沉淀過(guò)夜，離心分離沉淀、過(guò)濾，除去濾渣，得樟芝粗多糖樣品溶液，采用硫酸-蒽酮法測(cè)定多糖含量[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用DPS 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟科植物水提物對(duì)樟芝生物量的影響

圖1 為11種樟科植物水提物對(duì)菌絲體生物量影響的程度及其多重比較結(jié)果，各實(shí)驗(yàn)組與A 間差異均極顯著（F=173.34，P＜0.01），其中B12的促進(jìn)作用最強(qiáng)，其次是B11，雖不屬于樟屬但自然生長(zhǎng)海拔和牛樟最為接近、且在臺(tái)灣也有自然分布的新木姜子對(duì)樟芝生長(zhǎng)的促進(jìn)與B12最為接近，緊隨其后的是B7，雖然猴樟在臺(tái)灣沒(méi)有自然分布，但海拔在700～1 480 m 與牛樟樹(shù)比較吻合。B2，B10，B1，B3，B6，B8，B4，B9對(duì)樟芝生長(zhǎng)的促進(jìn)作用依次減弱，而自然分布在浙江、江西、福建等地生長(zhǎng)海拔在400～1 000 m 的香桂（對(duì)應(yīng)B5處理）對(duì)樟芝生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最弱，但與A 相比，促進(jìn)作用仍然達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。

圖1 11種樟科植物水提物對(duì)樟芝生物量的影響Figure 1 Effects of water extracts of 11 species of Lauraceae plants on production of biomass

圖2 11種樟科植物水提物對(duì)樟芝總?cè)坪康挠绊慒igure 2 Effects of water extracts of 11 species of Lauraceae plants on the triterpenoids production

2.2 樟科植物水提物對(duì)樟芝菌絲體總?cè)坪康挠绊?/h3>

從圖2 中可以看出11種樟科植物水提物對(duì)樟芝菌絲體總?cè)坪康挠绊?，與A 相比，除B4對(duì)總?cè)坪坑幸种谱饔猛猓渌量浦参锒急憩F(xiàn)為不同程度的促進(jìn)作用，差異極為顯著（F=3 908.5，P＜0.01）。

自然生長(zhǎng)海拔和牛樟樹(shù)最為接近、且在臺(tái)灣也有自然分布的新木姜子雖然不屬于樟屬，但是其對(duì)總?cè)坪康拇龠M(jìn)作用最為顯著，與A 相比增加量可達(dá)13 倍，與B12相比也提高了85.0 %。其次為B8，與A 相比增加量達(dá)10 倍，與B12相比提高了78.5%。且B7、B10對(duì)于總?cè)坪康拇龠M(jìn)作用顯著高于B12。緊隨B12后的是B9，B1，B2和B6，均極顯著高于A，且B1和B2之間無(wú)顯著差異；與牛樟樹(shù)同屬、自然海拔非常接近且在臺(tái)灣有自然分布的B3，以及與牛樟樹(shù)同屬、自然海拔差不多且自然分布接近的B5對(duì)總?cè)坪侩m促進(jìn)作用較弱，但與A相比仍達(dá)極顯著差異水平。

2.3 樟科植物水提物對(duì)樟芝菌絲體總多糖含量的影響

圖3 中與A 相比，除了B3和B9對(duì)樟芝菌絲體總多糖含量有較為明顯抑制的作用，大多數(shù)樟科植物都能不同程度的提高樟芝菌絲體總多糖的含量，且差異極顯著（F=121.4，P＜0.01）。其中B12的促進(jìn)作用最為顯著，B11對(duì)總多糖含量的促進(jìn)作用也極為顯著，與A 相比增加量可達(dá)5 倍；B7 對(duì)于總多糖含量的促進(jìn)作用緊隨B11后，與A 相比增加量可達(dá)3.5 倍。B1，B5，B6，B8均較A 有極顯著差異，但這4 組組間無(wú)顯著差異，B10，B2對(duì)總多糖的促進(jìn)作用依次減弱，但與A 相比仍有極顯著差異。

3 結(jié)論與討論

樟科植物本身就含有多種活性成分，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其中的某些成分可促進(jìn)樟芝菌絲體的生長(zhǎng)，提高樟芝菌絲體總?cè)坪涂偠嗵堑暮浚皇遣煌恼量浦参飳?duì)于樟芝菌絲體的促進(jìn)程度不同，同時(shí)樟科植物中的某些成分可能也會(huì)抑制樟芝菌絲體的總?cè)坪涂偠嗵堑暮俊?/p>

圖3 11種樟科植物水提物對(duì)樟芝總多糖含量的影響Figure 3 Effects of water extracts of 11 species of Lauraceae plants on the polysaccharide production

11種樟科植物水提物對(duì)樟芝菌絲體的生長(zhǎng)均有不同程度的促進(jìn)作用，其中新木姜子、猴樟、天竺桂和華南桂的水提物對(duì)樟芝菌絲體的生長(zhǎng)有較明顯的促進(jìn)作用。11種樟科植物對(duì)樟芝菌絲體總?cè)坪康挠绊懖町愝^大，新木姜子、蘭嶼肉桂和猴樟水提物對(duì)總?cè)坪康挠绊戄^大，分別比無(wú)添加組增加了13 倍、10 倍和10 倍，比前期優(yōu)化的液體培養(yǎng)分別提高了85.0%，78.5%和78.5%，產(chǎn)生顯著的促進(jìn)作用，天竺桂水提物對(duì)總?cè)坪康挠绊懧源笥谇捌趦?yōu)化的培養(yǎng)基，而其他8種樟科植物在不同程度均有較小的促進(jìn)作用。11種樟科植物對(duì)樟芝菌絲體總多糖含量的影響均不及前期優(yōu)化的液體培養(yǎng)基，除新木姜子、猴樟水提物對(duì)總多糖含量的影響相對(duì)較大，更為接近前期優(yōu)化的培養(yǎng)基的作用之外，與無(wú)添加組相比，山橿、黃樟、銀木、蘭嶼肉桂、香桂、天竺桂和華南桂水提物均有不同程度的促進(jìn)作用，而樟和浙江樟水提物則表現(xiàn)出一定的抑制作用。對(duì)樟芝菌絲體的生物量、總?cè)坪涂偠嗵沁M(jìn)行綜合分析，添加新木姜子水提物對(duì)于樟芝的液體培養(yǎng)促進(jìn)作用最為顯著，其次是猴樟。

這11種樟科植物分別屬于樟屬、山胡椒屬和新木姜子屬，而從植物分類學(xué)上看分別，前者屬于樟亞科的樟族，后兩者屬于木姜子族。根據(jù)ISSR 親緣關(guān)系分析，不同屬的樟科植物分類與樟科分類中的族一致，屬間植物完全分開(kāi)，而屬內(nèi)植物全聚在一起，與傳統(tǒng)植物形態(tài)分類一致，說(shuō)明屬內(nèi)植物之間的親緣性更近。根據(jù)劉玉香等人的研究表明[23]，樟科植物的核型類型有“1A”，“1B”，“2A”和“2B”四種類型，本次實(shí)驗(yàn)中樟屬的黃樟、樟均為“2A”型，牛樟、銀木為“2B”型，而新木姜子屬的新木姜子和山胡椒屬的山橿分別為“2B”型。一般來(lái)說(shuō)，“2A”型屬于較為原始類型，“2B”型在系統(tǒng)演化中更為進(jìn)化。在這次實(shí)驗(yàn)中核型表現(xiàn)出差異的樟水提物對(duì)總多糖有較為明顯的抑制作用，對(duì)總?cè)坪途z體生長(zhǎng)均只有非常小的促進(jìn)作用，與樟同是“2A”型的黃樟促進(jìn)作用也較低。和牛樟同是“2B”型的新木姜子水提物促進(jìn)效果最佳，雖然它和牛樟是不同族不同屬，但是同是“2B”型的不同族不同屬的山橿水提物以及同族同屬的銀木水提物卻在菌絲體生物量、總?cè)?、總多糖上表現(xiàn)出和新木姜子水提物較大的差異。所以相同的核型不是促進(jìn)樟芝液體培養(yǎng)的唯一因素。

在這11種樟科植物中對(duì)于樟芝菌絲體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最小的，且對(duì)總?cè)?、總多糖促進(jìn)作用都不大的是自然生長(zhǎng)海拔最低的香桂，同樣相對(duì)低海拔的華南桂的促進(jìn)作用也不是很明顯；而自然生長(zhǎng)在海拔1 450～2 000 m的新木姜子對(duì)樟芝菌絲體生長(zhǎng)、總?cè)坪涂偠嗵呛康拇龠M(jìn)作用最大，而與牛樟、新木姜子相同核型但卻與新木姜子表現(xiàn)出較大差異的山橿和銀木的自然生長(zhǎng)海波都在1 000 m 以下；同時(shí)，自然海拔在700～1 480 m 的猴樟在菌絲體生長(zhǎng)、總?cè)坪涂偠嗵呛康拇龠M(jìn)作用都顯著高于前期優(yōu)化的液體培養(yǎng)基。故我們推測(cè)自然生長(zhǎng)海拔高的樟科植物和牛樟可能有某些相同的成分，可促進(jìn)樟芝的液體培養(yǎng)。

從這11種樟科植物的自然分布來(lái)看，在臺(tái)灣有的新木姜子、蘭嶼肉桂、天竺桂均表現(xiàn)出較好的促進(jìn)作用。根據(jù)臺(tái)灣木本植物的大陸親緣性特征分析[24]，雖然受到臺(tái)灣島嶼的地質(zhì)、地形地貌、氣候影響下形成臺(tái)灣特有的樹(shù)種，但這些植物可能從第3 紀(jì)中開(kāi)始由大陸的西南向東遷移，所以臺(tái)灣木本被子植物在大陸更多屬于西南、華南、華東區(qū)域，很少屬于西北、東北區(qū)域。故雖然猴樟的自然分布在西南區(qū)域，也可表現(xiàn)出較好的促進(jìn)作用，而自然分布在西北的銀木雖然和牛樟樹(shù)是相同核型卻因?yàn)殚L(zhǎng)久以來(lái)環(huán)境的差異導(dǎo)致植物體內(nèi)物質(zhì)有較大的差異，對(duì)樟芝液體培養(yǎng)的促進(jìn)作用不大。

綜上所述，核型、高海拔、自然分布一致或接近等因素均可能影響到樟科植物內(nèi)的一些成分，而這些成分中可能具有促進(jìn)樟芝菌絲體生長(zhǎng)、總?cè)坪涂偠嗵堑淖饔?，雖然其作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。但是，樟科植物水提物的添加對(duì)樟芝液體培養(yǎng)提高其生物量、總?cè)?、總多糖含量提供了?chuàng)新性的方法。