產(chǎn)酶益生芽孢桿菌的篩選

任平等

摘要：從畜禽動(dòng)物胃腸道分離具有產(chǎn)酶能力及抑菌活性的芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行耐酸、耐膽鹽、產(chǎn)酶能力及抑菌試驗(yàn)，并結(jié)合其形態(tài)特征進(jìn)行生理生化試驗(yàn)鑒定。結(jié)果表明，J2、J3和J14具有較強(qiáng)的產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的特性，N7和N10產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)，5株芽孢桿菌均有較強(qiáng)的抑菌活性并且能抵抗高濃度胃酸、膽鹽的不良環(huán)境，具有較高的存活數(shù)。初步鑒定J3為地衣芽孢桿菌，J14、J2為蠟樣芽孢桿菌，N7、N10枯草芽抱桿菌。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)酶；益生芽孢桿菌；形態(tài)特征；抑菌；生理生化；產(chǎn)酶能力；低pH值耐受性；高膽鹽耐受性；飼用益生菌

中圖分類(lèi)號(hào)： Q93-331文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0362-03

收稿日期：2013-12-27

基金項(xiàng)目：陜西省西安市科技計(jì)劃（編號(hào)：NC10013）。

作者簡(jiǎn)介：任平（1972—），女，陜西臨潼人，副研究員，主要從事微生物資源的應(yīng)用開(kāi)發(fā)。E-mail：mysrenping@163.com。芽孢桿菌（Bacillus）是一類(lèi)重要的微生物資源，因其具有強(qiáng)抗逆性、抗胃酸、抗干燥、耐高溫高壓、易貯存等生物特性而成為近20年發(fā)展起來(lái)的新型活菌綠色飼料添加劑，在畜牧業(yè)和飼料行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。當(dāng)微生態(tài)制劑所用的芽抱桿菌進(jìn)入動(dòng)物消化道后，能分泌活性很強(qiáng)的胞外酶（蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶），僅降解飼料中相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分，提高消化率，降低料肉比[1]，可刺激機(jī)體本身酶的活性，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能[2]；并且可拮抗病原微生物，維持和調(diào)整腸道微生態(tài)平衡，減少腹瀉，預(yù)防疾病。它具有抗生素和酶的雙重功效，在替代抗生素、防治畜禽疾病和改善環(huán)境等方面的積極作用已經(jīng)得到了公認(rèn)，在綠色畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的開(kāi)發(fā)前景[3]。

微生態(tài)制劑的生命力全賴(lài)于其所選菌種及菌種間相互配合是否嚴(yán)格，按微生態(tài)學(xué)規(guī)律精心篩選和制備。由于宿主的正常菌對(duì)本宿主（包括人或動(dòng)物）有其特異性，因此選擇微生態(tài)制劑的菌種要求利用本動(dòng)物體內(nèi)所分離的菌種，因?yàn)楸緞?dòng)物的菌種對(duì)其宿主腸道有較強(qiáng)的黏附性，對(duì)其他宿主則表現(xiàn)出低黏附性或不黏附。益生菌菌株定植的宿主特異性直接影響益生菌制劑的應(yīng)用效果，因而菌種的分離選擇必須注意到宿主特異性問(wèn)題[4]，從動(dòng)物胃腸道分離的菌株，由于該菌株經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的歷史進(jìn)化過(guò)程與宿主形成了供體和受體的共生關(guān)系，一定程度上保證了菌株對(duì)動(dòng)物的安全性，而且畜禽解剖構(gòu)造和生理體溫與其他動(dòng)物不同，從其他（包括人、動(dòng)物、植物、土壤）處分離的菌種，很難在畜禽體內(nèi)存活，更談不上較強(qiáng)的黏附力，與致病菌爭(zhēng)奪附著點(diǎn)。因此，菌種的選擇對(duì)畜禽微生態(tài)制劑的應(yīng)用效果至關(guān)重要，理想的益生素菌種最好來(lái)自同源動(dòng)物的胃腸道。本研究從牛瘤胃及雞盲腸中篩選出對(duì)低pH值和高膽鹽有較好的耐受性、產(chǎn)酶能力及抑菌活性較強(qiáng)的芽孢桿菌菌株，為飼用益生菌產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來(lái)源雞盲腸內(nèi)容物、牛新鮮的瘤胃內(nèi)容物。

1.1.2指示菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、腸炎沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium），從北微生物研究所購(gòu)買(mǎi)。

1.1.3培養(yǎng)基（1）肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏 5.0 g，蛋白胨 3 g，NaCl 5 g，水 1 L，pH值7.2。（2）分離純化培養(yǎng)基：牛肉膏 50 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，水 1 L，pH值7.2。（3）CMC-Na（羧甲基纖維素鈉）培養(yǎng)基：CMC-Na 1%，大豆蛋白胨0.5%，酵母粉0.05%，K2HPO4 0.15%，MgSO4·7H2O 0.02%，NaCl 05%，瓊脂粉0.8%，pH值為7.0。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1芽孢桿菌的預(yù)篩選和增殖培養(yǎng)活雞剖殺，無(wú)菌操作刮取盲腸內(nèi)容物約5 g，置于盛有95 mL無(wú)菌生理鹽水的帶有玻璃珠的三角瓶中，充分振蕩搖勻；將三角瓶于80 ℃水浴中處理15 min，挑取水浴后的菌液于菌種純化培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，置于37 ℃下培養(yǎng)48 h，挑取單個(gè)菌落革蘭氏染色鏡檢，取G+芽孢桿菌繼續(xù)純化培養(yǎng)。取新鮮牛瘤胃內(nèi)容物5 g于95 mL滅菌生理鹽水中，振蕩搖勻，置于80 ℃水浴中 15 min；挑取水浴后的菌液于菌種純化培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單個(gè)菌落革蘭氏染色鏡檢，取G+芽孢桿菌繼續(xù)純化培養(yǎng)。

1.2.2芽孢桿菌的篩選挑取少量純培養(yǎng)的單菌落均勻涂于玻片上，進(jìn)行結(jié)晶紫簡(jiǎn)單染色并鏡檢，將產(chǎn)生芽孢且形態(tài)為桿狀的單菌落轉(zhuǎn)入斜面保存。

1.2.3pH值耐受性取1環(huán)斜面菌株接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min 下培養(yǎng) 36 h；再以5%的接種量接種于pH值為 3.0的肉湯培養(yǎng)液中，于37 ℃、180 r/min 下培養(yǎng)2 h；分別于0、2 h取樣，用無(wú)菌移液管取出1 mL進(jìn)行梯度稀釋10-1～10-7；取10-4～10-7梯度0.2 mL涂于平板上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算存活率。

1.2.4豬膽鹽耐受性以5%的接種量將種子液接入含 3 mg/mL 豬膽鹽的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min 下?lián)u瓶培養(yǎng) 2 h；分別于0、2 h取樣，用無(wú)菌移液管取出1 mL進(jìn)行梯度稀釋10-1～10-7；取10-4～10-7梯度0.2 mL涂于平板上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算存活率。

1.2.5產(chǎn)酶特性

1.2.5.1雞源微生物產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶特性挑選對(duì)低pH值和豬膽鹽耐受性較好的芽孢桿菌菌株，并用無(wú)菌牙簽將這些菌株分別點(diǎn)種于淀粉培養(yǎng)基和酪蛋白培養(yǎng)基中（以點(diǎn)種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板作為生長(zhǎng)對(duì)照），37 ℃培養(yǎng) 24 h后取出平板觀察透明圈大?。ǖ矸燮桨宸湃氡?4 ℃冷卻 12 h，再取出觀察透明圈大?。?。

1.2.5.2牛源微生物產(chǎn)纖維素酶特性挑選對(duì)低 pH 值和豬膽鹽耐受性較好的芽孢桿菌菌株，在CMC-Na平板上以3點(diǎn)種植方法培養(yǎng)48 h，再采用剛果紅染色30 min，依次用蒸餾水和1 mol/L NaCl徹底洗去染液，再用5%醋酸固定顏色，在菌落周?chē)纬赏该鞯木渥C明芽抱桿菌能產(chǎn)纖維素酶。分別測(cè)量透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），選擇兩者比值。

1.2.6抑菌試驗(yàn)將3種指示菌分別接種于肉湯液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min下?lián)u床培養(yǎng)24 h，活菌計(jì)數(shù)，將菌液濃度調(diào)為1億CFU/mL待用。采用瓊脂打孔擴(kuò)散法測(cè)定抑菌效果，過(guò)程為：在滅菌平皿中加入100 μL的 1億CFU/mL指示菌菌液，然后注入溫?zé)岬娜鉁腆w培養(yǎng)基，混勻，培養(yǎng)基厚度約為5 mm；待培養(yǎng)基冷卻后，用打孔器在培養(yǎng)基上打3～4個(gè)直徑為5 mm的孔，將待檢測(cè)的芽孢桿菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，于37 ℃下培養(yǎng)36 h；將菌液加滿于打好的孔中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑，重復(fù)3次。

1.2.7纖維素酶活性的測(cè)定采用DNS法。

2結(jié)果與分析

2.1芽孢桿菌的篩選

利用芽孢的耐熱特性，對(duì)樣品進(jìn)行水浴，達(dá)到篩選的目的。通過(guò)水浴處理和增殖培養(yǎng)，試驗(yàn)共分離耐熱菌株40株，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，從中篩選出21株芽孢桿菌。

2.2耐受低 pH值芽孢桿菌株的篩選

根據(jù)菌體產(chǎn)酶特性和對(duì)病原菌的抑菌效果，J2、J3、J14具有較強(qiáng)的產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的特性，N7和N10產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)，5株芽孢桿菌均有抑菌作用。經(jīng)其形態(tài)特征、菌落特征、生理生化特征分析，初步鑒定J3為地衣芽孢桿菌，J14、J2為蠟樣芽孢桿菌，N7、N10枯草芽抱桿菌。

參考文獻(xiàn)：

[1]秦玉昌，潘寶海，于榮，等. 芽孢桿菌對(duì)畜禽生產(chǎn)性能的影響[J]. 中國(guó)飼料，2004（16）：8-10.

[2]高漢橋，陳昌福. 水庫(kù)爆發(fā)性色病及其防治技術(shù)研究[J]. 水利漁業(yè)，1997（2）：11-13.

[3]王振華. 高產(chǎn)酶活枯草芽孢桿菌制劑在奶牛生產(chǎn)上的應(yīng)用研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（27）：11771-11773，11776.

[4]趙瑞香，李元瑞，孫俊良，等. 嗜酸乳桿菌在模擬胃腸環(huán)境中抗性的研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2002，29（2）：35-38.

[5]Chou L S，Weimer B. Isolation and characterization of acid-and bile-tolerant isolates from strains of Lactobacillus acidophilus[J]. Journal of Dairy Science，1999，82（1）：23-31.?；燮?，楊雪，王丁，等. 高效石油降解菌BS-8產(chǎn)生物表面活性劑的性能[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（10）：365-367.

高效石油降解菌BS-8產(chǎn)生物表面活性劑的性能?；燮?， 楊雪1， 王丁1， 邢文會(huì)1， 夏鐵騎2， 張紅1

（1.河南教育學(xué)院生命科學(xué)系，河南鄭州 450046； 2.濮陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南濮陽(yáng)457000）摘要：培養(yǎng)6～30 h，隨著菌體數(shù)量的迅速增加，菌株BS-8表面張力從63.2 mN/m快速下降為39.4 mN/m，其表面活性劑產(chǎn)生方式為生長(zhǎng)相關(guān)型；以葡萄糖為碳源，對(duì)菌株BS-8的培養(yǎng)液經(jīng)離心、沉淀、顯色，顯示其表面活性劑為脂肽類(lèi)物質(zhì)，從培養(yǎng)液中分離純化得到表面活性劑的產(chǎn)量為0.58 g/L，其臨界膠束濃度（CMC）為90 mg/L；在pH值 4～9、溫度20～70 ℃、NaCl濃度1%～6%的條件下，菌株BS-8產(chǎn)生物表面活性劑的穩(wěn)定性較強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：石油；降解菌BS-8；生物表面活性劑；脂肽類(lèi)物質(zhì)；穩(wěn)定性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0365-03

收稿日期：2014-01-18

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：142102110123、122102310350）；河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃（編號(hào)：12A180008）；河南教育學(xué)院青年課題（編號(hào)：20090105）。

作者簡(jiǎn)介：?；燮迹?970—），女，河南新鄉(xiāng)人，博士，副教授，主要從事微生物資源開(kāi)發(fā)與應(yīng)用研究。Tel：（0371）69303781；E-mail： shengwuchp@126.com。

通信作者：張紅，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究。Tel：（0371）69303663；E-mail： angela9922@sina.com。生物表面活性劑是利用酶或微生物等，通過(guò)生物催化和生物合成等技術(shù)，從微生物、植物或動(dòng)物上得到的具有表面活性的物質(zhì)，按化學(xué)結(jié)構(gòu)不同分為糖脂類(lèi)、脂肽和脂蛋白類(lèi)、磷脂和脂肪酸類(lèi)、聚合表面活性劑類(lèi)和微粒表面活性劑等五大類(lèi)[1]，其類(lèi)型既與菌株有關(guān)，也與作為底物的碳源有關(guān)。有研究表明，碳源對(duì)微生物表面活性劑的產(chǎn)量和結(jié)構(gòu)具有決定性作用，烴類(lèi)物質(zhì)的存在尤其是烴鏈長(zhǎng)度對(duì)培養(yǎng)液中表面活性劑的濃度也會(huì)有顯著的影響[2]。不同的生物表面活性劑具有不同的分離、提取和濃縮方法，有的生物表面活性劑用乙酸乙酯提取，有的用二氯甲烷或甲醇與三氯甲烷按1 ∶2的比例提取。生物表面活性劑有較強(qiáng)的理化穩(wěn)定性，可被應(yīng)用于極端環(huán)境下，如地衣芽孢桿菌（Baclicus licheniform）產(chǎn)生的脂肽可以在75 ℃條件下耐熱140 h，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）產(chǎn)生的類(lèi)蛋白表面活性劑在pH值為 1.7～11.4范圍內(nèi)均非常穩(wěn)定[3]。生物修復(fù)被烴類(lèi)和原油污染的土壤是生物表面活性劑的一個(gè)重要應(yīng)用，同時(shí)還可用于受鈾、鉻和鉛等毒性重金屬污染地區(qū)的生物修復(fù)[4]。筆者所在課題組從長(zhǎng)期受石油污染的土壤中篩選到1組產(chǎn)生物表面活性劑的菌株，對(duì)具有較高表面活性劑產(chǎn)量及活性的菌株BS-8（Bacillus sp.）產(chǎn)生物表面活性劑進(jìn)行提取、純化，并對(duì)影響表面活性劑穩(wěn)定性的因素進(jìn)行探討，為生物表面活性劑及其產(chǎn)生菌在石油污染土壤的生物修復(fù)中提供一些理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株

降解菌BS-8從長(zhǎng)期受石油污染的土壤中篩選到[5]。

1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂20 g/L，pH值 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 20.0 g/L、（NH4）2SO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、Na2HPO4 2.0 g/L、CaCl2·H2O 0.005 g/L，pH值7.0～7.2。

1.3表面張力的測(cè)定[6]

采用圓環(huán)法測(cè)定表面張力。室溫下，用JYW-200A自動(dòng)表面張力測(cè)定儀測(cè)定上清液的表面張力，3次重復(fù)。

1.4菌株BS-8產(chǎn)表面活性劑與菌體生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)關(guān)系

將菌株BS-8以10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min下振蕩培養(yǎng)，每隔6 h取樣，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的D600 nm，并測(cè)定離心后發(fā)酵上清液的表面張力。

1.5菌株BS-8產(chǎn)生物表面活性劑的性能分析

1.5.1生物表面活性劑的定性分析將菌株BS-8活化后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、160 r/min 下振蕩培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，用6 mol/L HCl將其pH值調(diào)至2～3，置于4 ℃冰箱中過(guò)夜，觀察其是否會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，若出現(xiàn)白色沉淀，則上清液中含脂肽類(lèi)或脂蛋白類(lèi)表面活性劑；若沒(méi)有白色沉淀，則表明菌株產(chǎn)生了糖脂類(lèi)表面活性劑[7]。

為進(jìn)一步確定表面活性劑的性質(zhì)，通過(guò)顯色反應(yīng)分析表面活性劑的類(lèi)型。通過(guò)雙縮脲、茚三酮顯色反應(yīng)確定上清液中含肽鍵的脂肽、脂蛋白類(lèi)表面活性劑；通過(guò)莫氏試驗(yàn)驗(yàn)證上清液中是否含糖或糖的衍生物。用乙酸乙酯萃取上清液中的表面活性劑，萃取液濃縮作硅膠薄層層析，展開(kāi)劑為三氯甲烷-甲醇（體積比為9 ∶1），顯色劑為苯酚-硫酸-無(wú)水乙醇（比例為3 g ∶10 mL ∶25 mL），糖脂類(lèi)表面活性劑顯棕色斑點(diǎn)；顯色劑為含 0.5%茚三酮的無(wú)水丙酮溶液，脂肽、脂蛋白類(lèi)表面活性劑顯紅色斑點(diǎn)[8]。

1.5.2生物表面活性劑的提取與純化菌株BS-8活化后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液于10 000 r/min、4 ℃下離心 20 min ，以去除菌體；上清液用 6 mol/L HCl調(diào)pH值至2.0，4 ℃下靜置12 h，再次離心收集沉淀；用少量稀HCl洗滌沉淀，1 mol/L NaOH將沉淀pH值調(diào)至 7.0，冷凍干燥得到表面活性劑粗品[9]。

將表面活性劑粗品用CH2Cl2萃取，減壓蒸餾后溶于001 mol/L NaOH，濾紙過(guò)濾，再次用6 mol/L HCl將濾液pH值調(diào)至2.0，出現(xiàn)沉淀時(shí)于10 000 r/min下離心20 min，真空干燥得到純化的生物表面活性劑[10]。

1.5.3表面活性劑的臨界膠束濃度（CMC）的測(cè)定臨界膠束濃度指表面活性劑分子在溶劑中形成膠束時(shí)的最低濃度，是表面活性劑性能的一個(gè)重要指標(biāo)。當(dāng)溶液達(dá)到臨界膠束濃度時(shí)，溶液的表面張力降到了最低，此時(shí)表面活性劑濃度再增大，溶液的表面張力也不會(huì)再下降，而且形成大量的膠團(tuán)。CMC對(duì)應(yīng)的溶液表面張力就是表面活性劑能達(dá)到的最小表面張力。

用純化得到的表面活性劑樣品制成0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 mg/L系列濃度的表面活性劑水溶液，在室溫（25±1） ℃下測(cè)量各濃度表面活性劑水溶液的表面張力，以表面活性劑濃度為橫坐標(biāo)、溶液表面張力為縱坐標(biāo)繪制曲線，以確定表面活性劑的臨界膠束濃度。

1.6影響生物表面活性劑穩(wěn)定性的因素

取純化的表面活性劑樣品溶于蒸餾水中，配制成濃度為100 mg/L的溶液，研究pH值、溫度、鹽濃度等理化因子對(duì)其穩(wěn)定性的影響。

1.6.1溫度對(duì)生物表面活性劑穩(wěn)定性的影響分別將 100 mg/L 表面活性劑溶液加熱到20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃，保持2 h，冷卻至室溫后測(cè)定溶液的表面張力，觀察其熱穩(wěn)定性。

1.6.2 pH值對(duì)生物表面活性劑穩(wěn)定性的影響分別將 100 mg/L 表面活性劑溶液的pH值調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10、11，然后測(cè)定其表面張力，考察其對(duì)酸堿的耐受度。

1.6.3NaCl濃度對(duì)生物表面活性劑的影響分別在 100 mg/L 表面活性劑溶液中加入一定量的NaCl，混勻，使NaCl濃度為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%，靜置24 h后測(cè)其表面張力，考察其對(duì)鹽的耐受度。

2結(jié)果與分析

2.1表面活性劑的產(chǎn)生與菌體生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)關(guān)系

菌株BS-8在發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣，測(cè)定發(fā)酵液的D600 nm及離心上清液的表面張力，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、發(fā)酵液的表面張力為縱坐標(biāo)繪制BS-8的菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)表面活性劑的動(dòng)態(tài)關(guān)系（圖1）。由圖1可知，菌株BS-8在培養(yǎng)6 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，并開(kāi)始產(chǎn)生表面活性劑，6～30 h間菌體數(shù)量迅速增加，發(fā)酵液的表面張力隨菌體密度的增大而降低，表面張力快速下降（從63.2 mN/m下降為 39.4 mN/m）；30～54 h間細(xì)菌密度較高，并維持在一穩(wěn)定范圍內(nèi)，隨著菌體密度緩慢增長(zhǎng)，表面張力持續(xù)下降但降速減慢。發(fā)酵液的表面張力也降至最低（34.1 mN/m）；54～72 h間，菌體數(shù)量有所下降，表面張力有所增加。說(shuō)明生物表面活性劑的產(chǎn)生與菌體生長(zhǎng)過(guò)程密切相關(guān)，菌株BS-8的表面活性劑產(chǎn)生方式為生長(zhǎng)相關(guān)型。

2.2菌株BS-8產(chǎn)生物表面活性劑的性能分析

以葡萄糖為碳源，將菌株BS-8培養(yǎng)后的離心上清液pH值調(diào)至2～3，4 ℃冰箱中過(guò)夜，觀察到有白色沉淀產(chǎn)生，經(jīng)硅膠薄層層析后，含0.5%茚三酮的無(wú)水丙酮溶液顯紅色斑點(diǎn)，判斷上清液中含脂肽、脂蛋白類(lèi)表面活性劑。菌株BS-8振蕩培養(yǎng)72 h，從發(fā)酵離心上清液中提取表面活性劑，測(cè)得表面活性劑的含量為0.58 g/L。

將純化后的表面活性劑配制成不同濃度的水溶液，測(cè)定菌株 BS-8 產(chǎn)生的表面活性劑的CMC，結(jié)果見(jiàn)圖2。鄭新偉篩選到的菌株所產(chǎn)表面活性劑的CMC為130 mg/L，菌株 BS-8 的表面活性劑CMC為90 mg/L，兩者均比一般的化學(xué)表面活性劑的CMC值低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，所以在性能上更具優(yōu)越性[10]。圖2表明，表面活性劑的濃度從0增大到30 mg/L時(shí)，表面張力快速下降，從68.7 mN/m降到41.8 mN/m；隨著表面活性劑濃度的增大，表面張力下降幅度變小，當(dāng)表面活性劑濃度增大到90 mg/L時(shí)，表面張力降到最低（35.6 mg/L），表面活性劑濃度再升高，溶液的表面張力也不再降低。

2.3影響生物表面活性劑穩(wěn)定性的因素

2.3.1表面活性劑在不同溫度下的穩(wěn)定性將100 mg/L表面活性劑溶液分別加熱到不同溫度并保持2 h，室溫時(shí)各溶液表面張力的測(cè)定結(jié)果如表1所示。由表1可知，20～70 ℃之間，表面活性劑溶液的表面張力隨溫度的變化不大，基本保持在36.2～37.2 mN/m之間；當(dāng)溫度超過(guò)70 ℃以后，表面張力有較大提高。說(shuō)明菌株BS-8在20～70 ℃具有良好的熱穩(wěn)定性。

表1不同溫度下菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性

溫度（℃）表面張力（mN/m）2036.83036.24036.65036.96036.87037.28038.69039.810040.7

2.3.2表面活性劑在不同pH值下的穩(wěn)定性100 mg/L表面活性劑溶液在不同pH值下保持2 h，各溶液表面張力的測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2可知，pH值在4～9之間時(shí)，菌株產(chǎn)生的表面活性劑表面張力隨pH值的變化不太明顯，基本穩(wěn)定在36.5～37.5 mN/m；而當(dāng)pH值<4或pH值>9時(shí)，表面張力增加，強(qiáng)酸強(qiáng)堿影響表面活性劑的活性。但總的來(lái)說(shuō)，菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑有較寬的酸堿范圍。

表2pH值對(duì)菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性的影響

pH值表面張力（mN/m）338.3436.9536.6636.8736.9836.8937.21038.31139.8

2.3.3表面活性劑在不同NaCl濃度下的穩(wěn)定性將NaCl添加到含100 mg/L表面活性劑溶液中，使其成為一系列NaCl濃度梯度的溶液，保持2 h，測(cè)定各溶液的表面張力，結(jié)果如表3所示。表3表明，表面活性劑溶液的NaCl濃度在1%～6%之間，溶液表面張力的變化隨鹽度的變化很小，表面張力基本穩(wěn)定在36.5～37.2 mN/m范圍內(nèi)，說(shuō)明菌株BS-8產(chǎn)生的生物表面活性劑在NaCl濃度為1%～6%之間有較強(qiáng)的耐鹽性；當(dāng)NaCl濃度>6%時(shí)，表面張力增幅較大。

表3 不同鹽度下菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性

NaCl濃度（%）表面張力（mN/m）136.6236.8336.7436.9536.8637.2738.2838.8940.2

3結(jié)論

菌株BS-8的表面活性劑產(chǎn)生方式為生長(zhǎng)相關(guān)型，在培養(yǎng)6～30 h時(shí)，隨菌體數(shù)量的迅速增加，表面張力從 63.2 mN/m 快速下降為39.4 mN/m；之后，菌體密度緩慢增長(zhǎng)，表面張力持續(xù)下降但降速減慢。以葡萄糖為碳源培養(yǎng)菌株BS-8，培養(yǎng)液中含脂肽、脂蛋白類(lèi)表面活性劑，從培養(yǎng)液中分離、純化得到表面活性劑的產(chǎn)量為0.58 g/L，表面活性劑的CMC為90 mg/L。表面活性劑在pH值4～9、溫度20～70 ℃、NaCl濃度1%～6%的范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)：

[1]Benincasa M，Contiero J，Manresa M A，et al. Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa LBI growing on soapstock as the sole carbon source[J]. Journal of Food Engineering，2002，54（4）： 283-288.

[2]Kim H S，Jeon J W，Kim B H，et al. Extracellular production of a glycolipid biosurfactant，mannosylerythritol lipid，by Candida sp. SY16 using fed-batch fermentation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2006，70（4）：391-396.

[3]Lu J R，Zhao X B，Yaseen M. Biomimetic amphiphiles： biosurfactants[J]. Current Opinion in Colloid and Interface Seienee，2007，12：60-67.

[4]Meagher R B. Phytoremediation of toxic elemental and organic pollutants[J]. Current Opinion in Plant Biology，2000，3（2）： 153-162.

[5]夏鐵騎，?；燮?，張建清.產(chǎn)生物表面活性劑石油降解菌的篩選及高效降解菌群的構(gòu)建[J]. 農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究，2013，3（6）：49-51.

[6]曹娟，徐志輝，李凌之，等. 產(chǎn)生物表面活性劑的石油降解菌Acinetobacter BHSN 的研究[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2009，25（1）：73-78.

[7]冷凱良，楚曉珉，張輝珍，等. 微生物對(duì)石油烴降解代謝產(chǎn)物的分析方法研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究，2001，22（2）：57-61.

[8]董曉燕.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：46-47.

[9]Bordoloi N K，Konwar B K. Microbial surfactant-enhanced mineral oil recovery under laboratory conditions[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2008，63（1）： 73-82.

[10]鄭新偉.一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離及其產(chǎn)物性質(zhì)的研究[D]. 西安：西北大學(xué)，2011：31.

以葡萄糖為碳源，將菌株BS-8培養(yǎng)后的離心上清液pH值調(diào)至2～3，4 ℃冰箱中過(guò)夜，觀察到有白色沉淀產(chǎn)生，經(jīng)硅膠薄層層析后，含0.5%茚三酮的無(wú)水丙酮溶液顯紅色斑點(diǎn)，判斷上清液中含脂肽、脂蛋白類(lèi)表面活性劑。菌株BS-8振蕩培養(yǎng)72 h，從發(fā)酵離心上清液中提取表面活性劑，測(cè)得表面活性劑的含量為0.58 g/L。

將純化后的表面活性劑配制成不同濃度的水溶液，測(cè)定菌株 BS-8 產(chǎn)生的表面活性劑的CMC，結(jié)果見(jiàn)圖2。鄭新偉篩選到的菌株所產(chǎn)表面活性劑的CMC為130 mg/L，菌株 BS-8 的表面活性劑CMC為90 mg/L，兩者均比一般的化學(xué)表面活性劑的CMC值低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，所以在性能上更具優(yōu)越性[10]。圖2表明，表面活性劑的濃度從0增大到30 mg/L時(shí)，表面張力快速下降，從68.7 mN/m降到41.8 mN/m；隨著表面活性劑濃度的增大，表面張力下降幅度變小，當(dāng)表面活性劑濃度增大到90 mg/L時(shí)，表面張力降到最低（35.6 mg/L），表面活性劑濃度再升高，溶液的表面張力也不再降低。

2.3影響生物表面活性劑穩(wěn)定性的因素

2.3.1表面活性劑在不同溫度下的穩(wěn)定性將100 mg/L表面活性劑溶液分別加熱到不同溫度并保持2 h，室溫時(shí)各溶液表面張力的測(cè)定結(jié)果如表1所示。由表1可知，20～70 ℃之間，表面活性劑溶液的表面張力隨溫度的變化不大，基本保持在36.2～37.2 mN/m之間；當(dāng)溫度超過(guò)70 ℃以后，表面張力有較大提高。說(shuō)明菌株BS-8在20～70 ℃具有良好的熱穩(wěn)定性。

表1不同溫度下菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性

溫度（℃）表面張力（mN/m）2036.83036.24036.65036.96036.87037.28038.69039.810040.7

2.3.2表面活性劑在不同pH值下的穩(wěn)定性100 mg/L表面活性劑溶液在不同pH值下保持2 h，各溶液表面張力的測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2可知，pH值在4～9之間時(shí)，菌株產(chǎn)生的表面活性劑表面張力隨pH值的變化不太明顯，基本穩(wěn)定在36.5～37.5 mN/m；而當(dāng)pH值<4或pH值>9時(shí)，表面張力增加，強(qiáng)酸強(qiáng)堿影響表面活性劑的活性。但總的來(lái)說(shuō)，菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑有較寬的酸堿范圍。

表2pH值對(duì)菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性的影響

pH值表面張力（mN/m）338.3436.9536.6636.8736.9836.8937.21038.31139.8

2.3.3表面活性劑在不同NaCl濃度下的穩(wěn)定性將NaCl添加到含100 mg/L表面活性劑溶液中，使其成為一系列NaCl濃度梯度的溶液，保持2 h，測(cè)定各溶液的表面張力，結(jié)果如表3所示。表3表明，表面活性劑溶液的NaCl濃度在1%～6%之間，溶液表面張力的變化隨鹽度的變化很小，表面張力基本穩(wěn)定在36.5～37.2 mN/m范圍內(nèi)，說(shuō)明菌株BS-8產(chǎn)生的生物表面活性劑在NaCl濃度為1%～6%之間有較強(qiáng)的耐鹽性；當(dāng)NaCl濃度>6%時(shí)，表面張力增幅較大。

表3 不同鹽度下菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性

NaCl濃度（%）表面張力（mN/m）136.6236.8336.7436.9536.8637.2738.2838.8940.2

3結(jié)論

菌株BS-8的表面活性劑產(chǎn)生方式為生長(zhǎng)相關(guān)型，在培養(yǎng)6～30 h時(shí)，隨菌體數(shù)量的迅速增加，表面張力從 63.2 mN/m 快速下降為39.4 mN/m；之后，菌體密度緩慢增長(zhǎng)，表面張力持續(xù)下降但降速減慢。以葡萄糖為碳源培養(yǎng)菌株BS-8，培養(yǎng)液中含脂肽、脂蛋白類(lèi)表面活性劑，從培養(yǎng)液中分離、純化得到表面活性劑的產(chǎn)量為0.58 g/L，表面活性劑的CMC為90 mg/L。表面活性劑在pH值4～9、溫度20～70 ℃、NaCl濃度1%～6%的范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)：

[1]Benincasa M，Contiero J，Manresa M A，et al. Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa LBI growing on soapstock as the sole carbon source[J]. Journal of Food Engineering，2002，54（4）： 283-288.

[2]Kim H S，Jeon J W，Kim B H，et al. Extracellular production of a glycolipid biosurfactant，mannosylerythritol lipid，by Candida sp. SY16 using fed-batch fermentation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2006，70（4）：391-396.

[3]Lu J R，Zhao X B，Yaseen M. Biomimetic amphiphiles： biosurfactants[J]. Current Opinion in Colloid and Interface Seienee，2007，12：60-67.

[4]Meagher R B. Phytoremediation of toxic elemental and organic pollutants[J]. Current Opinion in Plant Biology，2000，3（2）： 153-162.

[5]夏鐵騎，?；燮?，張建清.產(chǎn)生物表面活性劑石油降解菌的篩選及高效降解菌群的構(gòu)建[J]. 農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究，2013，3（6）：49-51.

[6]曹娟，徐志輝，李凌之，等. 產(chǎn)生物表面活性劑的石油降解菌Acinetobacter BHSN 的研究[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2009，25（1）：73-78.

[7]冷凱良，楚曉珉，張輝珍，等. 微生物對(duì)石油烴降解代謝產(chǎn)物的分析方法研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究，2001，22（2）：57-61.

[8]董曉燕.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：46-47.

[9]Bordoloi N K，Konwar B K. Microbial surfactant-enhanced mineral oil recovery under laboratory conditions[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2008，63（1）： 73-82.

[10]鄭新偉.一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離及其產(chǎn)物性質(zhì)的研究[D]. 西安：西北大學(xué)，2011：31.

以葡萄糖為碳源，將菌株BS-8培養(yǎng)后的離心上清液pH值調(diào)至2～3，4 ℃冰箱中過(guò)夜，觀察到有白色沉淀產(chǎn)生，經(jīng)硅膠薄層層析后，含0.5%茚三酮的無(wú)水丙酮溶液顯紅色斑點(diǎn)，判斷上清液中含脂肽、脂蛋白類(lèi)表面活性劑。菌株BS-8振蕩培養(yǎng)72 h，從發(fā)酵離心上清液中提取表面活性劑，測(cè)得表面活性劑的含量為0.58 g/L。

將純化后的表面活性劑配制成不同濃度的水溶液，測(cè)定菌株 BS-8 產(chǎn)生的表面活性劑的CMC，結(jié)果見(jiàn)圖2。鄭新偉篩選到的菌株所產(chǎn)表面活性劑的CMC為130 mg/L，菌株 BS-8 的表面活性劑CMC為90 mg/L，兩者均比一般的化學(xué)表面活性劑的CMC值低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，所以在性能上更具優(yōu)越性[10]。圖2表明，表面活性劑的濃度從0增大到30 mg/L時(shí)，表面張力快速下降，從68.7 mN/m降到41.8 mN/m；隨著表面活性劑濃度的增大，表面張力下降幅度變小，當(dāng)表面活性劑濃度增大到90 mg/L時(shí)，表面張力降到最低（35.6 mg/L），表面活性劑濃度再升高，溶液的表面張力也不再降低。

2.3影響生物表面活性劑穩(wěn)定性的因素

2.3.1表面活性劑在不同溫度下的穩(wěn)定性將100 mg/L表面活性劑溶液分別加熱到不同溫度并保持2 h，室溫時(shí)各溶液表面張力的測(cè)定結(jié)果如表1所示。由表1可知，20～70 ℃之間，表面活性劑溶液的表面張力隨溫度的變化不大，基本保持在36.2～37.2 mN/m之間；當(dāng)溫度超過(guò)70 ℃以后，表面張力有較大提高。說(shuō)明菌株BS-8在20～70 ℃具有良好的熱穩(wěn)定性。

表1不同溫度下菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性

溫度（℃）表面張力（mN/m）2036.83036.24036.65036.96036.87037.28038.69039.810040.7

2.3.2表面活性劑在不同pH值下的穩(wěn)定性100 mg/L表面活性劑溶液在不同pH值下保持2 h，各溶液表面張力的測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2可知，pH值在4～9之間時(shí)，菌株產(chǎn)生的表面活性劑表面張力隨pH值的變化不太明顯，基本穩(wěn)定在36.5～37.5 mN/m；而當(dāng)pH值<4或pH值>9時(shí)，表面張力增加，強(qiáng)酸強(qiáng)堿影響表面活性劑的活性。但總的來(lái)說(shuō)，菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑有較寬的酸堿范圍。

表2pH值對(duì)菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性的影響

pH值表面張力（mN/m）338.3436.9536.6636.8736.9836.8937.21038.31139.8

2.3.3表面活性劑在不同NaCl濃度下的穩(wěn)定性將NaCl添加到含100 mg/L表面活性劑溶液中，使其成為一系列NaCl濃度梯度的溶液，保持2 h，測(cè)定各溶液的表面張力，結(jié)果如表3所示。表3表明，表面活性劑溶液的NaCl濃度在1%～6%之間，溶液表面張力的變化隨鹽度的變化很小，表面張力基本穩(wěn)定在36.5～37.2 mN/m范圍內(nèi)，說(shuō)明菌株BS-8產(chǎn)生的生物表面活性劑在NaCl濃度為1%～6%之間有較強(qiáng)的耐鹽性；當(dāng)NaCl濃度>6%時(shí)，表面張力增幅較大。

表3 不同鹽度下菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性

NaCl濃度（%）表面張力（mN/m）136.6236.8336.7436.9536.8637.2738.2838.8940.2

3結(jié)論

菌株BS-8的表面活性劑產(chǎn)生方式為生長(zhǎng)相關(guān)型，在培養(yǎng)6～30 h時(shí)，隨菌體數(shù)量的迅速增加，表面張力從 63.2 mN/m 快速下降為39.4 mN/m；之后，菌體密度緩慢增長(zhǎng)，表面張力持續(xù)下降但降速減慢。以葡萄糖為碳源培養(yǎng)菌株BS-8，培養(yǎng)液中含脂肽、脂蛋白類(lèi)表面活性劑，從培養(yǎng)液中分離、純化得到表面活性劑的產(chǎn)量為0.58 g/L，表面活性劑的CMC為90 mg/L。表面活性劑在pH值4～9、溫度20～70 ℃、NaCl濃度1%～6%的范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)：

[1]Benincasa M，Contiero J，Manresa M A，et al. Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa LBI growing on soapstock as the sole carbon source[J]. Journal of Food Engineering，2002，54（4）： 283-288.

[2]Kim H S，Jeon J W，Kim B H，et al. Extracellular production of a glycolipid biosurfactant，mannosylerythritol lipid，by Candida sp. SY16 using fed-batch fermentation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2006，70（4）：391-396.

[3]Lu J R，Zhao X B，Yaseen M. Biomimetic amphiphiles： biosurfactants[J]. Current Opinion in Colloid and Interface Seienee，2007，12：60-67.

[4]Meagher R B. Phytoremediation of toxic elemental and organic pollutants[J]. Current Opinion in Plant Biology，2000，3（2）： 153-162.

[5]夏鐵騎，常慧萍，張建清.產(chǎn)生物表面活性劑石油降解菌的篩選及高效降解菌群的構(gòu)建[J]. 農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究，2013，3（6）：49-51.

[6]曹娟，徐志輝，李凌之，等. 產(chǎn)生物表面活性劑的石油降解菌Acinetobacter BHSN 的研究[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2009，25（1）：73-78.

[7]冷凱良，楚曉珉，張輝珍，等. 微生物對(duì)石油烴降解代謝產(chǎn)物的分析方法研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究，2001，22（2）：57-61.

[8]董曉燕.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：46-47.

[9]Bordoloi N K，Konwar B K. Microbial surfactant-enhanced mineral oil recovery under laboratory conditions[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2008，63（1）： 73-82.

[10]鄭新偉.一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離及其產(chǎn)物性質(zhì)的研究[D]. 西安：西北大學(xué)，2011：31.