外泌體在胰腺癌中的研究進(jìn)展

楊翠紅，冉燕翠，鄭春燕，孫秀威

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，哈爾濱 150086

胰腺癌主要起源于胰腺導(dǎo)管上皮及腺泡細(xì)胞，早期診斷困難，生存期短，是預(yù)后極差的惡性腫瘤之一。胰腺癌主要為導(dǎo)管細(xì)胞癌，少數(shù)為腺泡細(xì)胞癌，胰腺棘皮癌和囊腺癌等較少見等。胰腺癌進(jìn)展較快，且胰腺血管、淋巴管豐富，腺泡沒有包膜覆蓋，早期易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。外泌體主要是細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中。外泌體可通過其攜帶的蛋白質(zhì)、核酸、脂類等來調(diào)控受體細(xì)胞的生物學(xué)活性。外泌體在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有至關(guān)重要的作用，本文就外泌體在胰腺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移、胰腺癌診斷及化療耐藥中的作用進(jìn)行綜述，為早期診斷和治療胰腺癌提供新的手段。

1 外泌體概述

外泌體是一種30～150 nm的納米級(jí)實(shí)體，由蛋白質(zhì)、RNA和脂類組成[1]。外泌體是由多種正常細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等）或腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜通過內(nèi)吞作用萌芽產(chǎn)生的胞外小泡，隨后形成多泡體，并通過胞吐作用釋放到血液和其他體液中[2-3]。外泌體含有廣泛的功能性信使 RNA（messenger RNA，mRNA）、微小 RNA（m icroRNA，miRNA）和蛋白質(zhì)，通過傳遞遺傳信息在細(xì)胞間通信中發(fā)揮重要作用，可以調(diào)節(jié)、指導(dǎo)并重新分配靶器官和周圍微環(huán)境的關(guān)系[4-5]。外泌體與受體細(xì)胞間的相互作用由外泌體膜蛋白介導(dǎo)，如磷脂酰絲氨酸和蛋白多糖受體[6]。此外，外泌體膜上存在特定的四次穿膜蛋白家族或整連蛋白，可選擇性地作用于靶細(xì)胞或靶器官發(fā)揮作用[7]。腫瘤細(xì)胞的外泌體常通過腫瘤組織與周圍基質(zhì)間的通訊激活細(xì)胞增殖和血管生成途徑，啟動(dòng)轉(zhuǎn)移前生態(tài)位并形成免疫抑制來促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[8]。

外泌體中蛋白質(zhì)因細(xì)胞的類型和狀態(tài)不同而有很大差別，目前通過質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)可以檢測出超過7000種的蛋白質(zhì)[9]。其中常見的蛋白質(zhì)為CD9、熱休克蛋白A8（heat shock protein A8，HSPA8）、程序性細(xì)胞死亡6相互作用蛋白（programmed cell death 6 interacting protein，PDCD6IP）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）、β肌動(dòng)蛋白[9]。研究顯示，人類基因組中超過1%的突變與癌變有關(guān)，突變蛋白如突變型Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）、間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（mesenchymal to epithelial transition factor，MET）蛋白和組織因子蛋白等均可通過外泌體釋放[10-12]。脂質(zhì)在維持外泌體細(xì)胞膜的剛性、穩(wěn)定性、融合和萌發(fā)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。外泌體脂質(zhì)可以攜帶其他有生物活性的脂質(zhì)，也可以攜帶第二信使，如磷脂酸、神經(jīng)酰胺和甘油二脂等[13]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體脂質(zhì)可通過抑制Notch1途徑誘導(dǎo)人胰腺癌SOJ-6細(xì)胞凋亡[14-15]。外泌體脂質(zhì)還可通過CXC趨化因子受體4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）/基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 1α（stromal cell-derived factor 1α，SDF1α）信號(hào)通路誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞耐藥。外泌體中含有miRNA、轉(zhuǎn)移RNA（transfer RNA，tRNA）、核糖體 RNA（ribosomal RNA，rRNA）、mRNA、DNA 和環(huán)狀RNA（circular DNA，circRNA）等[16-17]。其中miRNA是一類長為19～25 nt的非編碼RNA，能在轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因的表達(dá)或翻譯。miRNA可以破壞mRNA的穩(wěn)定性并抑制其翻譯，調(diào)控目的基因在多種細(xì)胞中的表達(dá)，并參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和代謝等重要的生物學(xué)過程[18]。外泌體作為一種納米級(jí)膜性小泡，含有多種宿主細(xì)胞衍生的生物活性分子，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和miRNA等，這些成分通過外泌體的運(yùn)輸，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的基因表達(dá)水平和細(xì)胞功能。外泌體可調(diào)控組織修復(fù)與免疫監(jiān)視等多種生理過程，在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2 外泌體在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用

胰腺癌是世界上較致命的腫瘤之一，進(jìn)展迅速，易早期轉(zhuǎn)移，早期診斷較困難，常規(guī)治療的作用有限，5年生存率僅約為8%[19]。胰腺癌具有廣泛的間質(zhì)組織，約占腫瘤體積的90%[20]。間質(zhì)組織可刺激胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，幫助腫瘤細(xì)胞逃離宿主的免疫監(jiān)視[21]。胰腺星狀細(xì)胞是一種重要的胰腺間質(zhì)細(xì)胞，類似于肝臟或其他臟器中星狀細(xì)胞群，最初是靜止的，在接受適當(dāng)刺激后可以轉(zhuǎn)化為活化的肌成纖維細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞的外泌體可誘導(dǎo)間質(zhì)干細(xì)胞分化為可生成α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的肌成纖維細(xì)胞，而肌成纖維細(xì)胞可直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長并刺激腫瘤血管生成[22]。研究表明，α-SMA表達(dá)陽性的胰腺癌星狀細(xì)胞在腫瘤相關(guān)的胰腺纖維化中發(fā)揮重要作用[23]。Masamune等[24]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌可分泌外泌體，激活胰腺癌星狀細(xì)胞和促纖維化過程，包括促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、膠原生成和α-SMA mRNA的表達(dá)，胰腺癌星狀細(xì)胞通過與胰腺癌細(xì)胞的動(dòng)態(tài)相互作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的形成。Costa-Silva等[25]研究發(fā)現(xiàn)，來源于胰腺癌的外泌體可被肝臟Kupffer細(xì)胞選擇性吸收，促進(jìn)轉(zhuǎn)化 生長因子-β（transforming grow th factor-β，TGF-β）的分泌，上調(diào)肝臟星狀細(xì)胞產(chǎn)生的纖維連接蛋白的表達(dá)。纖維連接蛋白在肝臟沉積，形成纖維化的微環(huán)境，促進(jìn)骨髓來源的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在肝臟聚集，從而形成有利于播散性胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的微環(huán)境，即生態(tài)位轉(zhuǎn)移。

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，低氧和炎性細(xì)胞浸潤（尤其是巨噬細(xì)胞）是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的兩個(gè)重要因素[26-27]。穩(wěn)定和激活缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞應(yīng)對(duì)缺氧反應(yīng)的主要機(jī)制，特別是HIF-1α和HIF-2α，可激活促進(jìn)腫瘤生長、血管生成和細(xì)胞轉(zhuǎn)移的原癌基因[28-29]。King等[30]研究認(rèn)為，低氧可能通過改變外泌體的釋放來調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間的通訊來促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。胰腺癌細(xì)胞可產(chǎn)生富含miRNA-21的外泌體，可以促進(jìn)低氧腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[31]。巨噬細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞周圍存在的最豐富的浸潤性免疫相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞。根據(jù)微環(huán)境的變化，巨噬細(xì)胞可以極化為經(jīng)典活化型（M 1）或替代活化型（M 2）。以表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）為特征的M 1型巨噬細(xì)胞具有促炎作用，而M 2型巨噬細(xì)胞表達(dá)較高水平的抗炎細(xì)胞因子和較強(qiáng)活性的精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1），有利于腫瘤細(xì)胞的生長[32-33]。Wang等[34]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞可通過分泌富含miRNA-301a的外泌體，經(jīng)磷酸酶與張力蛋白同系物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）/磷酸肌醇3-激酶γ（phosphatidylinositide 3-kinase γ，PI3Kγ）通路介導(dǎo)M 2型巨噬細(xì)胞極化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

3 外泌體在胰腺癌診斷中的應(yīng)用

磷脂酰肌醇蛋白聚糖 1（glypican 1，GPC1）是一種位于細(xì)胞表面的脂質(zhì)筏-硫酸乙酰肝素蛋白多糖，由558個(gè)氨基酸組成，其分子量約為62 kD[35]。Aikawa等[36]研究發(fā)現(xiàn)，GPC1可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，下調(diào)胰腺癌細(xì)胞系PANC-1中GPC1的表達(dá)，從而減慢胰腺癌細(xì)胞的生長速度，降低胰腺癌細(xì)胞的獨(dú)立生長能力。Melo等[37]利用流式細(xì)胞儀從胰腺癌患者和胰腺癌小鼠模型的血清外泌體中檢測并分離出GPC1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來源于胰腺癌細(xì)胞的外泌體富含GPC1，且胰腺癌患者血清外泌體中的GPC1具有高特異度和高靈敏度，可作為早期胰腺癌患者初診和預(yù)后的血清學(xué)檢測指標(biāo)。研究顯示，胰腺癌患者外泌體中miRNA-21和miRNA-17-5p的表達(dá)明顯上調(diào)，可用于鑒別胰腺癌與非惡性慢性胰腺炎[9]。Madhavan等[38]對(duì)胰腺癌患者血清外泌體中的5種起始腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物[CD104、MET、上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、四次穿膜蛋白8（tetraspanin 8，TSPAN8）和 CD44V6]和 4種 miRNA（miRNA-4306、miRNA-3976、miRNA-464和 miRNA-1246）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，評(píng)估胰腺癌患者血清外泌體中起始腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物和miRNA的表達(dá)水平，可明顯提高胰腺癌血清學(xué)檢測的靈敏度，同時(shí)還可對(duì)胰腺癌患者與健康者、非惡性慢性胰腺炎患者和胰腺良性病變患者進(jìn)行鑒別，特異度約為93%。因此，檢測血清中胰腺癌相關(guān)外泌體標(biāo)志物可提高胰腺癌的早期檢出率并及時(shí)制訂合理的治療方案，改善患者的預(yù)后。

4 外泌體在胰腺癌化療耐藥中的作用

以吉西他濱為主的化療方案是晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌的主要治療方法。但隨著致癌miRNA、抗凋亡酶和與細(xì)胞耐藥相關(guān)的信號(hào)通路的激活，胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療逐漸產(chǎn)生了耐藥性。且胰腺癌本身的間質(zhì)組織具有低血流灌注和低氧的特點(diǎn)，密集的間質(zhì)可通過物理屏障、高間質(zhì)壓力、壓迫血管和密集的間質(zhì)細(xì)胞等影響化療藥物的釋放[39]。因此，對(duì)化療藥物耐藥仍是影響胰腺癌患者化療療效和預(yù)后的最大障礙。外泌體可通過多種機(jī)制提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。來源于胰腺癌的外泌體可向特定細(xì)胞傳遞多種耐藥相關(guān)蛋白和miRNA來影響化療療效。胰腺癌細(xì)胞也可將進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的化療藥物通過外泌體包裹并分泌至血液或其他體液中，在一定程度上緩解化療藥物對(duì)胰腺癌細(xì)胞的損傷作用。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，但其在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低[9]。Asuncion Valenzuela等[40]在對(duì)胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）可明顯上調(diào)IAP的表達(dá)。來源于胰腺癌的外泌體中含有IAP的相關(guān)mRNA，化療時(shí)，胰腺癌細(xì)胞質(zhì)中IAP蛋白或mRNA的水平基本保持不變或中度上調(diào)。因此，來源于胰腺癌的外泌體可能通過抑制IAP的表達(dá)，增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。

miRNA-155是一個(gè)典型的多功能miRNA，由其下游基因介導(dǎo)，參與多種生理病理過程，如炎癥、免疫和腫瘤的發(fā)生發(fā)展[41]。miRNA-155可通過促進(jìn)過氧化氫酶和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等活性氧解毒酶的過表達(dá)，提高化療過程中胰腺癌細(xì)胞的存活率和耐藥性。胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體，還可通過miRNA-155抑制限速酶脫氧胞苷激酶（deoxycytidine kinase，DCK）的活性，從而干擾吉西他濱的代謝過程[42]。因此，胰腺癌細(xì)胞內(nèi)miRNA-155表達(dá)升高引起的正反饋?zhàn)饔每商岣吣[瘤細(xì)胞的抗凋亡活性[43]。吉西他濱化療時(shí)，胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）細(xì)胞內(nèi)的miRNA-155表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)外泌體中miRNA-155的過表達(dá)，并通過增強(qiáng)周圍腫瘤細(xì)胞的抗調(diào)亡活性來發(fā)揮耐藥作用[43-44]。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（carcinoma-associated fibroblast，CAF）對(duì)吉西他濱化療不敏感，可通過增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中外泌體的活性，來提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。Richards等[45]認(rèn)為胰腺癌患者在吉西他濱化療過程中，CAF可通過外泌體明顯提高snail和miRNA-146a的表達(dá)水平，從而促進(jìn)胰腺上皮細(xì)胞的耐藥和增殖，并能促進(jìn)耐藥PDAC細(xì)胞株的存活和增殖。

5 小結(jié)

胰腺癌患者預(yù)后極差，這可能是因?yàn)槎鄶?shù)患者診斷為胰腺癌時(shí)已處于晚期階段。外泌體在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，可通過誘導(dǎo)胰腺癌星狀細(xì)胞的激活和促纖維化活性，包括促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、膠原生成和α-SMA mRNA的表達(dá)，胰腺癌星狀細(xì)胞通過與胰腺癌細(xì)胞的動(dòng)態(tài)相互作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的形成。外泌體可通過誘導(dǎo)胰腺癌的生態(tài)位轉(zhuǎn)移，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；富含miRNA-301a的外泌體，可經(jīng)PTEN/PI3Kγ信號(hào)通路介導(dǎo)M 2型巨噬細(xì)胞的極化從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移；外泌體可作為胰腺癌早期診斷的可靠標(biāo)志物，用于篩選沒有臨床癥狀的高危個(gè)體并監(jiān)測疾病進(jìn)程；在吉西他濱化療過程中，來源于胰腺癌的外泌體可能通過抑制IAP表達(dá)和促進(jìn)miRNA-155過表達(dá)，提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。因此，外泌體在胰腺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移、胰腺癌診斷及化療耐藥中具有重要意義。隨著生物科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，外泌體有望用于指導(dǎo)胰腺癌的臨床治療，改善患者預(yù)后。