循環(huán)腫瘤DNA在乳腺癌中的研究進(jìn)展

劉翾，李映良，仲羅平，李強(qiáng)

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，南昌3300000

乳腺癌是全世界范圍內(nèi)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，位居女性腫瘤死亡原因的第2位[1]。液體活體組織檢查主要包括循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）檢測(cè)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）檢測(cè)和外泌體檢測(cè)。ctDNA最初來(lái)源于循環(huán)游離DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）。目前，ctDNA可以被新發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到，其不但可以對(duì)疾病進(jìn)行早發(fā)現(xiàn)和早診斷，并預(yù)測(cè)疾病的復(fù)發(fā)，還可以預(yù)測(cè)藥物不良反應(yīng)的發(fā)生[2]。本文就ctDNA在乳腺癌中的研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。

1 ctDNA的命名

1948年，Mandel和Metais[3]首次在血漿中檢測(cè)到細(xì)胞外游離DNA的存在。1977年，Leon等[4]采用放射免疫測(cè)定法測(cè)定173例不同類型腫瘤患者和55例健康者的血清游離DNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康者相比，腫瘤患者的血清游離DNA水平升高。1989年，Stroun等[5]證實(shí)了在腫瘤患者的血液中存在具有腫瘤特異性突變的DNA。Gormally等[6]建議將cfDNA中攜帶腫瘤特異性突變的片段命名為ctDNA，并發(fā)現(xiàn)ctDNA表現(xiàn)出與原發(fā)腫瘤組織相同的生物學(xué)特性。近年來(lái)，關(guān)于ctDNA的研究層出不窮，ctDNA作為一種新型的液體活體組織檢查指標(biāo)，可以協(xié)助臨床醫(yī)師對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)和判斷預(yù)后，在腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域中具有極大的價(jià)值。

2 ctDNA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展

ctDNA在血漿游離DNA中的含量極低，因此，ctDNA的檢測(cè)難度較大。目前，ctDNA的主要檢測(cè)方法是數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（digital polymerase chain reaction，dPCR）和二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)，dPCR的測(cè)序方法主要包括表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變檢測(cè)、突變阻滯擴(kuò)增系 統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）-PCR、BEAMing（beads、emulsion、amplification、magnetics）、微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR），其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單易行，成本低；其缺點(diǎn)是僅能分析單一的、數(shù)量有限的堿基對(duì)改變，目前僅能夠用于熱點(diǎn)突變的檢測(cè)，不能夠用于新突變的發(fā)現(xiàn)。NGS主要包括標(biāo)記擴(kuò)增深度測(cè)序（tagged-amplicon deep sequencing，TAm-seq）、安全測(cè)序系統(tǒng)和雙向測(cè)序，其優(yōu)點(diǎn)是能夠增加目標(biāo)基因的濃度，提高測(cè)序的敏感度，并可以達(dá)到高通量檢測(cè)突變序列；其缺點(diǎn)是成本太高，難以在臨床中推廣。以PCR或NGS為基礎(chǔ)的高敏感度、高通量檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步使在大量的cfDNA中辨別出少量的與腫瘤相關(guān)的單核苷酸變異（single nucleotide variant，SNV）、拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）和基因結(jié)構(gòu)變異（structural variant，SV）等遺傳學(xué)改變成為可能，從而實(shí)現(xiàn)ctDNA的定量和定性檢測(cè)[7]。

dPCR的概念最早是由Sykes等[8]提出的，dPCR技術(shù)所能提供的DNA量化信息是以線性的數(shù)字化形式體現(xiàn)的。ddPCR將微流控技術(shù)與dPCR技術(shù)結(jié)合起來(lái)，該技術(shù)對(duì)突變的檢測(cè)具有較高的靈敏度和特異度，其可在一次的dPCR檢測(cè)中對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行定量分析，大大提高了檢測(cè)率，在醫(yī)學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域中具有重要的意義。

NGS技術(shù)可以對(duì)大規(guī)模的、并行的DNA片段進(jìn)行連續(xù)識(shí)別，為疾病的研究做出了巨大的貢獻(xiàn)。NGS相關(guān)的TAm-seq方法豐富了樣品序列，從而提高了標(biāo)準(zhǔn)NGS技術(shù)檢測(cè)的靈敏度。除此之外，雙向測(cè)序和個(gè)性化重組末端分析（personalized analysis of rearranged end，PARE）等技術(shù)的快速發(fā)展使ctDNA和cfDNA的檢測(cè)變得可行。NGS技術(shù)引領(lǐng)了腫瘤基因組的新方向，不僅使人們對(duì)腫瘤基因組學(xué)的前景有了新的認(rèn)識(shí)，還有助于基因改造和生物標(biāo)志物的鑒定，從而預(yù)測(cè)了特定療法的治療效果。

3 乳腺癌患者中ctDNA突變的檢測(cè)情況

既往研究發(fā)現(xiàn)，在不同類型的腫瘤中，均可以通過(guò)dPCR和NGS技術(shù)檢測(cè)到原癌基因和抑癌基因的突變[9]。Jansen等[10]對(duì)45個(gè)基因進(jìn)行了NGS，并分析了原發(fā)性腫瘤組織、正常組織以及腫瘤患者血清樣本中的cfDNA，通過(guò)dPCR技術(shù)檢測(cè)到了與乳腺癌相關(guān)的基因突變（如PIK3CA突變）。Higgins等[11]對(duì)乳腺癌患者血漿中的ctDNA進(jìn)行了PIK3CA突變的檢測(cè)，結(jié)果顯示，約30%的乳腺癌患者被檢測(cè)到存在PIK3CA突變，且乳腺癌患者血清中PIK3CA的突變狀態(tài)與腫瘤中標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序的結(jié)果一致。2012年，《Nature》刊發(fā)了關(guān)于乳腺癌基因組圖譜的相關(guān)研究結(jié)果，學(xué)者們利用全外顯子組測(cè)序等方法對(duì)825例乳腺癌患者的DNA樣本進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有的乳腺癌中，TP53、PIK3CA和GATA3基因突變的檢出率超過(guò)10%[12]。對(duì)于TP53和PIK3CA等突變率較高的基因，由于其在許多腫瘤亞型中均出現(xiàn)，因此，在腫瘤的進(jìn)展中更容易被發(fā)現(xiàn)，又因其具有相對(duì)較高的靈敏度和特異度，使其更容易被檢測(cè)到。2016年，有研究對(duì)560例乳腺癌患者的乳腺癌組織標(biāo)本進(jìn)行了基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了93個(gè)可能與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)的蛋白編碼基因的1628種突變[13]。其他與臨床有關(guān)的突變檢測(cè)也可以輔助如人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）等的靶向治療，這也引起了學(xué)者們對(duì)治療反應(yīng)預(yù)測(cè)和耐藥性監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的研究興趣。

4 ctDN A在乳腺癌中的臨床應(yīng)用

ctDNA檢測(cè)技術(shù)可以改變臨床醫(yī)師對(duì)疾病做出治療決策的模式，并對(duì)腫瘤的進(jìn)展情況進(jìn)行實(shí)時(shí)評(píng)估，也有助于監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展并確定合理的治療方法，而不需要進(jìn)行重復(fù)的活體組織檢查。

4.1 診斷與篩查

乳腺癌的早期診斷具有重要的意義，以目前的治療手段來(lái)看，早期乳腺癌被認(rèn)為是可治愈的，且患者的預(yù)后良好。一種可以篩查乳腺癌的標(biāo)志物對(duì)存在乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的人十分有益。Agassi等[14]將38例未行手術(shù)治療的乳腺癌患者、2例良性乳腺病變患者、9例術(shù)后乳腺癌患者、16例健康者和29例非腫瘤住院女性納入研究，測(cè)定了cfDNA水平后發(fā)現(xiàn)術(shù)前乳腺癌患者的cfDNA水平為（1010±642）ng/ml，分別明顯高于健康者的（395±248）ng/ml、良性乳腺病變患者的（386±40）ng/ml、非腫瘤住院女性的（492±193）ng/ml和術(shù)后乳腺癌患者的（398±162）ng/ml，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示cfDNA濃度檢測(cè)可用于乳腺癌的早期診斷。由于活體組織檢查難以克服腫瘤內(nèi)部或不同病灶的異質(zhì)性及腫瘤遺傳變異可能隨著時(shí)間的改變而發(fā)生改變的局限，相比較而言，ctDNA可以提供更加全面精確的腫瘤遺傳組學(xué)信息。ctDNA檢測(cè)對(duì)于早期乳腺癌具有協(xié)助診斷價(jià)值，PIK3CA突變是乳腺癌患者最常見(jiàn)的基因突變之一[15]。TP53和PIK3CA等位基因的突變可作為乳腺癌患者無(wú)進(jìn)展生存情況極好的預(yù)測(cè)因子[16]。Leary等[17]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ctDNA的濃度＞0.75%時(shí)，ctDNA診斷乳腺癌的靈敏度為90%，特異度為99%。定義ctDNA濃度閾值的另一個(gè)因素是ctDNA鑒別良惡性腫瘤的能力，但ctDNA濃度在乳腺良惡性腫瘤間是否存在差異尚無(wú)定論。

在乳腺癌的早期診斷方面，ctDNA比傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物具有更高的靈敏度和特異度。Zill等[18]利用Guardant 360檢測(cè)方法對(duì)1.5萬(wàn)例晚期腫瘤患者的體細(xì)胞基因組進(jìn)行了分析，其中，乳腺癌患者占14%，ctDNA對(duì)乳腺癌的檢出率為83%；該研究對(duì)386例患者的血漿和組織測(cè)序結(jié)果亦進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示，血漿ctDNA檢測(cè)結(jié)果與組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)出良好的一致性。

4.2 反映預(yù)后

隨著時(shí)間的變化，ctDNA可能能夠反映腫瘤負(fù)荷情況、預(yù)測(cè)腫瘤患者的預(yù)后和評(píng)估腫瘤患者的治療效果。對(duì)于臨床醫(yī)師來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)移性乳腺癌的管理非常困難，因?yàn)槊坷颊叩那闆r不同，且無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的參考指南。因此，迫切需要通過(guò)提高監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷動(dòng)態(tài)的生物標(biāo)志物的準(zhǔn)確性來(lái)確定治療效果。傳統(tǒng)的腫瘤生物標(biāo)志物如糖類抗原15-3（carbohydrate antigen 15-3，CA15-3）和CTC已被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。有研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA是一種可靠的工具，可以監(jiān)測(cè)正在接受全身治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的腫瘤負(fù)荷動(dòng)態(tài)[19]。Dawson等[20]比較了30例接受全身治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的影像學(xué)結(jié)果與ctDNA、CA15-3水平對(duì)疾病預(yù)后情況的預(yù)測(cè)情況，結(jié)果顯示，ctDNA水平呈現(xiàn)出與疾病更為相關(guān)的動(dòng)態(tài)波動(dòng)，與腫瘤負(fù)荷變化的關(guān)系更大，且ctDNA為10例患者提供了最早的治療反饋。雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）突變常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中。Chandarlapaty等[21]進(jìn)行了BOLERO-2試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)乳腺癌患者血漿樣本的cfDNA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在所有可評(píng)價(jià)的乳腺癌患者中，28.8%的患者存在ESR1突變，而在ctDNA中發(fā)現(xiàn)存在ESR1突變的患者的預(yù)后較差，因此，通過(guò)檢測(cè)ctDNA是否攜帶ESR1突變可以判斷疾病的發(fā)生與否。但ESR1突變對(duì)于疾病預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值仍然存在爭(zhēng)議，仍需要今后進(jìn)行更多的研究加以驗(yàn)證。盡管如此，現(xiàn)有研究的數(shù)據(jù)仍然提示，治療后，對(duì)血漿中ESR1突變的分析可能有助于乳腺癌治療方法的選擇，為患者提供進(jìn)一步的治療方案。

4.3 預(yù)測(cè)早期復(fù)發(fā)

早期乳腺癌的臨床癥狀缺乏特異性，當(dāng)乳腺癌患者出現(xiàn)明顯的臨床癥狀或經(jīng)影像學(xué)檢查才發(fā)現(xiàn)時(shí)，往往已屬于晚期。從這個(gè)角度看，乳腺癌的早期復(fù)發(fā)干預(yù)可能會(huì)給乳腺癌患者帶來(lái)益處。Olsson等[22]對(duì)20例術(shù)后乳腺癌患者的血液標(biāo)本進(jìn)行了ctDNA檢測(cè)，結(jié)果顯示，ctDNA預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)的特異度為100%，靈敏度為93%；與影像學(xué)檢查的預(yù)測(cè)情況相比，在86%的乳腺癌患者中，ctDNA平均提早了11個(gè)月預(yù)測(cè)了乳腺癌的復(fù)發(fā)。該研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與術(shù)后血液中未檢測(cè)到ctDNA的患者相比，能檢測(cè)到ctDNA乳腺癌患者的無(wú)病生存期（disease-free survival，DFS）明顯縮短，且ctDNA的含量與患者的生存期有關(guān)。Janku等[23]研究了通過(guò)ctDNA確定不同類型腫瘤（包括乳腺癌）患者生存時(shí)間的方法，結(jié)果顯示，腫瘤患者的生存時(shí)間與突變類型無(wú)關(guān)，突變型ctDNA的數(shù)量與患者的總生存期有關(guān)。Garcia-Murillas等[24]采用dPCR和靶向測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了行新輔助化療的早期乳腺癌患者的ctDNA，結(jié)果表明，ctDNA能夠用于預(yù)測(cè)治療后乳腺癌的復(fù)發(fā)。

4.4 評(píng)估治療反應(yīng)

ctDNA技術(shù)可用于監(jiān)測(cè)化療、內(nèi)分泌治療和放射治療等治療手段的治療反應(yīng)，是一種有前景的監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的新方法。

局部晚期乳腺癌（locally advanced breast cancer，LABC）一般是指腫瘤直徑大于5 cm或伴有皮膚和胸壁粘連固定的乳腺癌，多存在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但尚無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的證據(jù)，有治愈的希望，不屬于晚期乳腺癌，但也有異于尋常的早期乳腺癌或中期乳腺癌。LABC通常會(huì)在有效的外科治療之前采用新輔助化療（neoadjuvant chemotherapeutic，NAC）以縮小腫瘤的直徑、微轉(zhuǎn)移灶的范圍及數(shù)量。Kim等[25]收集了15個(gè)序列樣本，檢測(cè)到13個(gè)乳腺癌組織的體細(xì)胞發(fā)生改變，還發(fā)現(xiàn)腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）突變?cè)谠l(fā)性腫瘤組織和血漿中最容易被檢測(cè)到，其次是BRCA1和BRCA2突變；此外，該研究還分析了NAC的治療效果，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)樣本的ctDNA在第一個(gè)NAC周期后消失，且實(shí)體腫瘤達(dá)到了病理完全緩解（pathologic complete response，pCR），并通過(guò)進(jìn)行超深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)ctDNA可能是NAC效果的最重要預(yù)測(cè)因子。Riva等[26]采用ddPCR檢測(cè)了46例非轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌患者的TP53突變情況，于4個(gè)時(shí)間點(diǎn)（NAC前1個(gè)周期、NAC后1個(gè)周期、術(shù)前、術(shù)后）分別收集了10 ml血漿，結(jié)果顯示，在治療過(guò)程中，除1例患者外，其他患者的ctDNA水平均有所下降；在NAC期間，ctDNA水平升高的患者發(fā)生了腫瘤進(jìn)展，表明ctDNA水平的升高與患者較低的無(wú)病生存率和總生存率有關(guān)。

在檢測(cè)輔助治療的療效方面，ctDNA中某些特殊分子（如RASSFIA甲基化）的變化趨勢(shì)與腫瘤負(fù)荷的改變一致，證實(shí)了ctDNA在檢測(cè)療效方面的能力[27]。Dawson等[20]利用靶向測(cè)序和全基因組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在30例轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中存在TP53或PIK3CA基因突變或結(jié)構(gòu)變異，證明利用dPCR檢測(cè)可以通過(guò)上述基因突變的變化情況檢測(cè)疾病的進(jìn)展情況。Schiavon等[28]在乳腺癌患者的ctDNA中檢測(cè)到了ESR1突變。ESR1突變會(huì)引起患者對(duì)芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitor，AI）的耐藥性，而在進(jìn)行個(gè)體化治療時(shí)，ESR1突變分析可以用于指導(dǎo)激素受體陽(yáng)性患者的內(nèi)分泌治療。

4.5 評(píng)估耐藥性

Murtaza等[29]對(duì)2例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的血漿ctDNA進(jìn)行了全外顯子測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因突變率的升高與治療耐藥有關(guān)。其中，對(duì)1例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的分析結(jié)果顯示，PIK3CA（E545K）突變頻率的升高與紫杉醇耐藥有關(guān)；治療前，PIK3CA（E545K）的突變頻率為14%，經(jīng)過(guò)治療且患者發(fā)生耐藥后，PIK3CA（E545K）的突變頻率升高至34%。另外1例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的分析結(jié)果顯示，MED1（S1179X）突變頻率的升高與他莫昔芬聯(lián)合曲妥珠單抗耐藥有關(guān)，治療前，MED1（S1179X）的突變頻率為4%，經(jīng)過(guò)治療且患者發(fā)生耐藥后，MED1（S1179X）的突變頻率升高至15%，提示MED1突變與他莫昔芬耐藥有關(guān)。GAS6基因突變頻率的升高與拉帕替尼聯(lián)合卡培他濱二線治療耐藥有關(guān)。并且，該研究對(duì)1例雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性和HER2陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者進(jìn)行全外顯子測(cè)序，結(jié)果顯示，經(jīng)拉帕替尼治療并發(fā)生耐藥后，患者血漿ERBB4（H809G）突變的頻率明顯升高，他莫昔芬聯(lián)合曲妥珠單抗治療并發(fā)生耐藥后，患者血漿中PIK3CA（E542K）的突變頻率明顯升高。

5 其他體液中ctDNA的分析方法

尿液：血液系統(tǒng)中的ctDNA可通過(guò)腎過(guò)濾后排出。此外，對(duì)于腎臟疾病或泌尿生殖系統(tǒng)疾病，尿液可以作為一個(gè)更為集中的樣本來(lái)源監(jiān)測(cè)疾病。尿液中的DNA存在兩種形式，即＜100 bp和150～250 bp[30]。尿液ctDNA已應(yīng)用于多種腫瘤類型的研究中，尤其是泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤。Hann等[31]研究發(fā)現(xiàn)，尿液標(biāo)志物可能是肝癌復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的有效工具。尿液收集具有非侵入性和允許大樣本量獲得的優(yōu)點(diǎn)，有利于應(yīng)用于兒科腫瘤學(xué)領(lǐng)域。

腦脊液：中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者的血漿DNA濃度明顯低于其他實(shí)體腫瘤患者，雖然獲得腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）腰椎穿刺和外科腫瘤活體組織檢查均具有侵襲性，但CSF分析的臨床實(shí)用性最終將取決于測(cè)試的有效性和臨床問(wèn)題重要性之間的平衡。

6 小結(jié)與展望

液體活體組織檢查作為精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域的一門新技術(shù)，使早期腫瘤的篩查成為可能，在腫瘤診斷、治療方案選擇、療效評(píng)估及預(yù)后預(yù)測(cè)等方面均具有極高的臨床應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。尤其在以預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移為主旨的腫瘤免疫治療的臨床療效評(píng)價(jià)體系方面，液體活體組織檢查將有助于腫瘤免疫治療的科學(xué)發(fā)展和對(duì)臨床實(shí)踐的精準(zhǔn)指導(dǎo)。ctDNA作為液體活體組織檢查的新型腫瘤標(biāo)志物，與傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物相輔相成，具有極高的臨床應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)前景，使實(shí)現(xiàn)真正個(gè)體化治療成為可能。理論上，ctDNA對(duì)于乳腺癌患者的個(gè)體化治療具有指導(dǎo)意義，但該領(lǐng)域的研究仍處于起步階段，其臨床應(yīng)用仍然需要更多的研究進(jìn)一步證實(shí)，期待未來(lái)ctDNA成為乳腺癌精準(zhǔn)治療的重要手段。