miRNA在實體腫瘤診斷及治療中的研究進展

楊鑫苗，張永強

1北京醫(yī)院腫瘤內(nèi)科/國家老年醫(yī)學(xué)中心，北京100730

2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京1007300

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類廣泛存在于動物、植物、病毒體內(nèi)的可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達的小分子RNA。自1993年首個miRNA被發(fā)現(xiàn)以來，人們陸續(xù)在自然界中發(fā)現(xiàn)了超過3萬種miRNA；而且發(fā)現(xiàn)這些miRNA參與細胞的增殖、分化、凋亡及機體的免疫調(diào)節(jié)和發(fā)育等過程，在心血管系統(tǒng)疾病、腫瘤、內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)疾病中均具有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、腎癌、子宮內(nèi)膜癌等多種實體腫瘤中表達紊亂[1]，提示miRNA可能參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程。此外，miRNA可作為腫瘤篩查的標(biāo)志物，在腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、療效監(jiān)測和評價、預(yù)后判斷等方面發(fā)揮作用。另一方面，miRNA也可以參與腫瘤耐藥的形成，改變腫瘤細胞對化療、放療的敏感性，具有潛在的腫瘤治療作用。

1 miRNA的發(fā)現(xiàn)、合成及作用機制

Lee等[2]在研究秀麗隱桿線蟲時，通過定位克隆法發(fā)現(xiàn)了第一個miRNA相關(guān)基因lin-4，并觀察到其在不同的階段能夠調(diào)控胚胎的發(fā)育。Reinhart等[3]在對線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)了miRNA let-7，其在線蟲幼蟲向成蟲發(fā)育的過程中發(fā)揮調(diào)控作用。此后，人們利用生物分子學(xué)技術(shù)不斷探索新的miRNA，目前人類基因組中已確定的miRNA超過2000種。

miRNA的合成過程復(fù)雜，miRNA基因首先在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成含有幾百或幾千個核苷酸的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（pri-miRNA）；隨后pri-miRNA在細胞核內(nèi)經(jīng)過RNAaseⅢ內(nèi)切酶家族成員Drosha和其伴侶分子DGCR8所形成的復(fù)合物的作用，被剪切成約含有70個核苷酸的miRNA前體分子（premiRNA），該前體具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且成熟的miRNA基因多成簇分布于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3'或5'端，這與多個miRNA共同調(diào)節(jié)同一mRNA的翻譯或降解有關(guān)；緊接著pre-miRNA在轉(zhuǎn)運蛋白Exporting-5的作用下，從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中[4]；在細胞質(zhì)中，premiRNA經(jīng)過核糖核酸酶Dicer的作用被剪切成為成熟的雙鏈miRNA，在解旋酶的作用下，雙鏈miRNA的一條鏈很快被降解，另一條鏈則形成具有活性的成熟miRNA，成熟miRNA與核糖核蛋白體結(jié)合，組成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA induced silencing complex，RISC）[5]。RISC通過與靶mRNA不同程度地結(jié)合，引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯，調(diào)控基因的表達。

2 miRNA作為腫瘤標(biāo)志物

腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)對降低患者的復(fù)發(fā)率，提高生存率及改善預(yù)后具有重要意義。因此，尋找有意義的腫瘤標(biāo)志物，提高腫瘤的早期檢出率，是臨床面臨的一個難題。miRNA在血液、尿液、漿膜腔積液等內(nèi)穩(wěn)定存在，且不易被分解破壞，因而其有望成為腫瘤早期篩查的標(biāo)志物。

Chen等[6]對53例早期乳腺癌患者、40例乳腺良性腫瘤患者及49例健康者的血清樣本進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌患者血清中miRNA-21、miRNA-152的表達明顯上調(diào)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示兩者均有可能作為乳腺癌早期篩查的指標(biāo)。另有研究發(fā)現(xiàn)，早期前列腺癌患者血清中 miRNA-125b、miRNA-221/miRNA-222、let-7b等的表達下調(diào)，而miRNA-25、miRNA-93的表達上調(diào)，這為臨床篩查早期前列腺癌提供了可能[7]。Jin等[8]選取46例Ⅰ期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者和42例健康者的血清樣本，通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)對比健康者、肺腺癌患者和肺鱗癌患者血清中miRNA的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-181-5p、miRNA-30a-3p、miRNA-30e-3p、miRNA-361-5p在肺腺癌患者血清中的表達具有高度特異性，而miRNA-10b-5p、miRNA-15b-5p、miRNA-320b在肺鱗癌患者血清中的表達具有特異性，提示上述miRNA可作為早期識別NSCLC的特異性標(biāo)志物，并且對NSCLC的分型具有重要價值。為了進一步檢驗上述miRNA序列在早期診斷NSCLC中的精確性，研究者隨機選取了60例血清樣本（其中包括17例健康者的血清樣本和43例NSCLC患者的血清樣本），利用qRT-PCR技術(shù)檢測各血清樣本中miRNA-181-5p、miRNA-361-5p的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-181-5p、miRNA-361-5p聯(lián)合檢測可鑒別出31例肺腺癌患者的血清，其曲線下面積達0.936；同樣的，聯(lián)合檢測miRNA-10b-5p、miRNA-320b可鑒別出11例肺鱗癌患者的血清，其曲線下面積為0.911。證明上述miRNA作為NSCLC早期篩查的指標(biāo)具有較高的準(zhǔn)確性。有研究對比了正常結(jié)腸（normal colonic，N）、管狀腺瘤（tubular adenoma，ADT）、絨毛狀管狀腺瘤（tubulovillous adenoma，ADTV）和結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）匹配的組織與外周血中循環(huán)miRNA的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與ADT和ADTV患者相比，CRC患者外周血中miRNA-149*、miRNA-3196、miRNA-4687的表達異常；而與健康者相比，CRC患者外周血中miRNA-612、miRNA-1296、miRNA-933、miRNA-937、miRNA-1207的表達異常。同樣，該研究還發(fā)現(xiàn)miRNA在上述4種組織中的表達情況與在外周血中的表達一致，這進一步提示循環(huán)miRNA可以作為腫瘤篩查的標(biāo)志物[9]。

miRNA還可以作為腫瘤進展、轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，從而更好地評估腫瘤患者的療效、鑒別復(fù)發(fā)及判斷預(yù)后。Tsukamoto等[10]通過檢測結(jié)直腸癌患者外周血、原發(fā)灶腫瘤組織、肝轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織中miRNA-21的表達情況，發(fā)現(xiàn)在上述3種標(biāo)本中，miRNA-21的表達均明顯上調(diào)，提示外周血與腫瘤組織中miRNA-21的表達具有一致性。同時，該研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-21高表達的直腸癌患者的無病生存期（disease-free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）均短于miRNA-21低表達患者，提示外周血miRNA-21是Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者DFS、OS的獨立預(yù)測因素，同時也是Ⅳ期結(jié)直腸癌患者總生存的預(yù)測因子。Chanudet等[11]研究發(fā)現(xiàn)，相比于健康者和Ⅰ期腎透明細胞癌患者，miRNA-150在Ⅲ、Ⅳ期腎透明細胞癌患者血清中表達失調(diào)，提示miRNA-150可作為腎癌進展至晚期的標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)，嗅素蛋白4（olftactomedin 4，OLFM4）可以抑制三陰性乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移[12]。Xiong等[13]利用miRNA數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，OLFM4的上游物質(zhì)為miRNA-103，其通過作用于OLFM4的3'-UTR末端從而下調(diào)OLFM4的表達，在三陰性乳腺癌患者體內(nèi)可以檢測到miRNA-103的高表達，其表達程度與三陰性乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)；單因素與多因素分析結(jié)果均顯示，miRNA-103是三陰性乳腺癌患者預(yù)后的負性預(yù)測因子。

miRNA代謝酶類的缺失也可以作為惡性腫瘤的預(yù)后評價指標(biāo)。Khoshnaw等[14]利用免疫組織化學(xué)法檢測了乳腺原位癌組織、早期浸潤性乳腺癌組織、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織以及正常乳腺組織中Dicer酶的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常乳腺組織相比，Dicer酶在乳腺癌組織中的表達逐漸缺失，且其在原位癌中的表達缺失較少，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的表達缺失較重。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中，Dicer酶的缺失程度與影響乳腺癌患者預(yù)后的因素有關(guān)，如更高級別的病理分級、激素受體的缺失、乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）蛋白的低表達以及短的DFS，而這在人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌中相關(guān)性更顯著，提示Dicer酶的表達情況可作為評估HER2陽性乳腺癌預(yù)后的一項獨立指標(biāo)。

然而miRNA在外周血中的濃度極低，這提高了循環(huán)miRNA的檢測難度；同時，僅有少數(shù)研究顯示循環(huán)miRNA與組織miRNA的表達一致。另有大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤組織與外周血中的表達并不具有一致性，提示非腫瘤因素，如免疫細胞、血細胞、組織細胞同樣可以分泌某些腫瘤miRNA。因此，尚需要大規(guī)模的實驗數(shù)據(jù)來印證已發(fā)現(xiàn)的miRNA的臨床意義。

3 miRNA參與腫瘤耐藥機制的形成

miRNA的多態(tài)性及表達失調(diào)均會影響其下游靶mRNA的功能，如果該影響涉及到藥物吸收、分布、代謝相關(guān)通路上的關(guān)鍵分子，導(dǎo)致藥物作用失調(diào)，將是細胞產(chǎn)生耐藥性的基礎(chǔ)。腫瘤細胞耐藥的形成是影響腫瘤治療效果及預(yù)后的重要因素。腫瘤細胞耐藥機制的形成主要包括以下幾個方面：①miRNA干擾DNA化學(xué)修飾相關(guān)基因，影響表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的某些關(guān)節(jié)酶如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）的表達。②miRNA可以影響DNA損傷修復(fù)能力，這一點在鉑類藥物的耐藥機制中尤為重要。③miRNA調(diào)節(jié)一系列耐藥相關(guān)基因和蛋白的表達，如多藥耐藥基因 1（multidrug resisitance gene 1，MDR1）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance-related protein，MRP）。④miRNA影響ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族，ABC轉(zhuǎn)運蛋白是一類利用三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水解釋放的能量，逆濃度梯度通過細胞膜轉(zhuǎn)運化合物的蛋白，如P-糖蛋白、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）等。⑤miRNA影響一些信號通路的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)，如Ras-促分裂原活化的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號通路。

研究發(fā)現(xiàn)，部分miRNA如miRNA-181a[15]、miRNA-218[16-17]、miRNA-196a[18]等，可以預(yù)測腫瘤的耐藥性。Hu等[16]在兩種乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/A02和CALDOX中檢測到miRNA-218的表達降低，而異位表達miRNA-218后，兩種細胞重新獲得了對蒽環(huán)類和紫杉類藥物的敏感性。然而，通過RNA干擾機制先行下調(diào)生存素（BIRC5）后，再上調(diào)miRNA-218的表達則可以使兩種細胞再次獲得耐藥性。這提示miRNA-218可以通過促進BIRC5的表達而提高乳腺癌細胞對蒽環(huán)類、紫杉類化療藥物的敏感性。Lin等[17]運用四唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolim，MTT）、流式細胞術(shù)對比了食管癌細胞系Eca9706與鉑類耐藥細胞Eca9706-CisR的細胞活性和凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鉑類耐藥細胞Eca9706-CisR的miRNA-218表達明顯下調(diào)，而增強miRNA-218表達則可以增加耐藥細胞對鉑類藥物的敏感性，抑制細胞的活性，促進細胞凋亡；進一步運用qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，miRNA-218作用的直接靶點為BIRC5。

一項針對乳腺癌細胞耐藥機制的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-200a高表達可以增強乳腺癌細胞系對吉西他濱、紫杉醇、順鉑等化療藥物的耐藥性，減少化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡，而抑制miRNA-200a表達則可以改善吉西他濱耐藥乳腺癌細胞的藥物敏感性；進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲降TP53INP1和YAP1可以模擬miRNA-200a高表達的細胞模型，而TP53INP1與miRNA-200a的表達呈負相關(guān)[19]，表明miRNA-200a與腫瘤細胞的耐藥性有關(guān)，而TP53INP1和YAP1可能為其作用靶點。

腫瘤耐藥性已經(jīng)成為根治腫瘤的主要難題，miRNA在調(diào)節(jié)腫瘤耐藥性方面起著重要作用。通過分析敏感細胞和耐藥腫瘤細胞miRNA表達譜的差異，找到可以影響藥物治療效果的miRNA，有助于深入認識腫瘤耐藥機制，為尋找更為特異的耐藥靶點及個體化治療提供依據(jù)。

4 miRNA與腫瘤治療

一種miRNA可以有幾十個靶點，調(diào)控多種腫瘤細胞的多條信號通路，最終改變腫瘤細胞的生物學(xué)特性。腫瘤的主要生物學(xué)特征均涉及miRNA表達水平的變化。隨著實體腫瘤發(fā)病率的不斷增高，腫瘤的治療成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)亟待解決的問題之一。以miRNA為靶點的一系列類似物或抑制劑的合成，通過調(diào)控相應(yīng)miRNA的表達，減弱腫瘤細胞的增殖能力，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，有望成為惡性腫瘤治療的新策略。其調(diào)控機制主要有如下幾種：抗miRNA寡核苷酸鏈（anti-miRNA oligonucleotide，AMO）[20]、miRNA拮抗鏈[21]。目前，miRNA模擬物以及攜帶miRNA的脂質(zhì)體、可降解的生物材料（如多聚陽離子聚胺酯-短支-聚乙烯亞胺）、藥物介導(dǎo)的miRNA改變等治療方法已取得一定的進展，但這些方法均有一定的局限性，使其無法在臨床大規(guī)模應(yīng)用[22-24]。

生物體內(nèi)的miRNA數(shù)量龐大，遠不止理論上的飽和值，其作用機制復(fù)雜，絕大多數(shù)miRNA的功能仍未明確?，F(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展、基因組測序工程的加快推進、蛋白衍生技術(shù)的發(fā)展為進一步探索miRNA的功能提供了幫助。隨著miRNA功能不斷得到明確，與此相關(guān)的腫瘤診斷和治療逐漸成為可能。如何將已有的研究成果運用于腫瘤的篩選、診治和預(yù)后評估，仍需要大量的實驗研究。隨著一系列腫瘤耐藥基因的發(fā)現(xiàn)，miRNA介導(dǎo)的耐藥性概念的提出為惡性實體腫瘤患者的個體化治療帶來了希望。所有基于miRNA治療的策略無論是單獨應(yīng)用或是與傳統(tǒng)藥物聯(lián)合，均具有良好的發(fā)展前景。設(shè)計安全而穩(wěn)定的miRNA靶點激動劑或拮抗劑，尋找合適的miRNA轉(zhuǎn)運方式，將現(xiàn)有研究結(jié)果轉(zhuǎn)換為有意義的臨床結(jié)論，使miRNA成為腫瘤治療的新靶點，將是未來研究的熱點方向。

由于miRNA具有多樣性，仍然存在諸多問題亟待解決：如目前針對miRNA自身調(diào)節(jié)的機制研究甚少，miRNA與其他非編碼RNA的相互作用則更是少有研究；miRNA的檢測花費巨大，目前尚處于實驗階段，無法大規(guī)模運用于臨床；以miRNA為靶點的治療是否可能引起其他基因的突變，從而誘發(fā)新的疾病，目前尚無確切結(jié)論。miRNA在實體腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，值得深入思考和研究。

5 小結(jié)

近年來，隨著人們對外泌體的研究不斷深入，miRNA作為其內(nèi)在載體，其功能不斷得到闡明。miRNA參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段，在腫瘤的早期診斷、判斷治療效果、判斷轉(zhuǎn)移等方面均具有重要價值。未來循環(huán)miRNA可能成為腫瘤診斷與判斷療效、評估預(yù)后的標(biāo)志物。miRNA功能的明確也為腫瘤治療提供了新途徑。因此，尋找腫瘤相關(guān)miRNA并深入研究其作用機制將對腫瘤患者的診斷和治療有著重要意義。