miRNA通過轉(zhuǎn)錄因子及EMT相關(guān)調(diào)控蛋白在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制研究

毛竹君，祝利民，盧艷琳，王俊軍，周浩，沈克平#

1上海市中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科，上海 200233

2上海市青浦區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科，上海 201400

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種短鏈非編碼RNA，參與調(diào)節(jié)人類30%以上編碼蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)[1]，在腫瘤發(fā)生中可能起促癌或抑癌作用。miRNA的表達(dá)與胃癌及其他腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并在腫瘤相關(guān)基因的調(diào)節(jié)中起重要作用[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的表達(dá)與胃癌患者的生存期有關(guān)，胃癌組織miRNA-9和miRNA-137表達(dá)水平升高與胃癌的TNM分期較晚、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存期較短有關(guān)，并以CUL4A為靶基因參與胃癌上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的生物學(xué)過程[3]。另一項(xiàng)研究采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測miRNA-124在88例胃癌患者中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-124的表達(dá)與胃癌患者的總生存期（overall survival，OS）密切相關(guān)[4]。研究顯示，miRNA-345的表達(dá)下調(diào)與胃癌患者局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較晚的TNM分期密切相關(guān)，miRNA-345的表達(dá)水平降低可縮短胃癌患者的OS和無病生存期（diseasefree interval，DFS）[5]。胃癌組織中miRNA-599的表達(dá)水平降低，常提示預(yù)后較差，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較晚的TNM分期有關(guān)。研究顯示，miRNA-599可以預(yù)測胃癌患者的5年生存率，預(yù)測價值較高[6]。miRNA參與胃癌發(fā)生發(fā)展生物學(xué)過程的具體機(jī)制值得深入研究。

EMT不僅可參與正常胚胎發(fā)育過程中器官和組織的生成過程，也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，EMT可使腫瘤細(xì)胞的間充質(zhì)表型發(fā)生改變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[7]。研究顯示，部分轉(zhuǎn)錄因子、生長因子及相關(guān)信號通路均可參與EMT過程[8]，而miRNA可通過調(diào)控原癌基因或抑癌基因來調(diào)控胃癌細(xì)胞的EMT過程。EMT是胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，snail、扭曲蛋白（TWIST）和E盒結(jié)合鋅指蛋白（zinc finger E-box binding homeobox，ZEB）等轉(zhuǎn)錄因子及其他EMT相關(guān)作用蛋白的上游靶基因均可能作為預(yù)測腫瘤遷移和侵襲的分子標(biāo)志物。機(jī)體發(fā)育過程可調(diào)控EMT的生物學(xué)過程，而機(jī)體的發(fā)育過程又受到TWIST1、ZEB等一系列轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，這些轉(zhuǎn)錄因子又是EMT過程的重要調(diào)控因子[9-10]，均可抑制E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。miRNA通過與靶基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）特異性結(jié)合，促使mRNA降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平。上述機(jī)制共同調(diào)控胃癌EMT的整個過程。本文就近年來miRNA與胃癌轉(zhuǎn)錄因子及EMT相關(guān)調(diào)控蛋白間的關(guān)系，及其參與腫瘤遷移和侵襲的分子機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 miRNA與轉(zhuǎn)錄因子snail

snail是重要的EMT轉(zhuǎn)錄因子，通過與E-pal盒（包含啟動子的2個毗鄰E盒）結(jié)合來抑制E-cadherin蛋白的轉(zhuǎn)錄，從而影響EMT過程，snail過表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[10]，并可作為預(yù)測胃癌疾病進(jìn)展及預(yù)后的獨(dú)立標(biāo)志物。miRNA-491-5p可以抑制多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其過表達(dá)可明顯抑制胃癌EMT過程和腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[11]。snail被認(rèn)為是miRNA-491-5p的目的基因，此外，miRNA-491-5p還可抑制成纖維細(xì)胞生長因子4（fibroblast growth factor 4，F(xiàn)GFR4）的轉(zhuǎn)錄，從而間接下調(diào)snail蛋白的表達(dá)并抑制胃癌EMT過程。miRNA-30a可與snail基因的3'-UTR結(jié)合，并抑制其表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-30a可能通過靶向調(diào)控snail蛋白的表達(dá)影響胃癌的EMT過程，從而影響胃癌腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，此外，miRNA-124、miRNA-506、miRNA-204及miRNA-203等也被證實(shí)具有類似作用[12-15]。

2 miRNA與轉(zhuǎn)錄因子TWIST

TWIST是堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loophelix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族成員，包括TWIST1和TWIST2兩種類型，均可參與EMT過程，在胃癌腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過程具有重要作用[16]。胃癌細(xì)胞和動物模型實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)，TWIST1能誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，miRNA-495過表達(dá)可明顯影響腫瘤細(xì)胞的存活和遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制EMT過程，TWIST1是miRNA-495的目的基因，TWIST1沉默后可部分逆轉(zhuǎn)miRNA-495對胃癌腫瘤細(xì)胞EMT過程的抑制作用[17]。miRNA-15a-3p和miRNA-16-1-3p也可影響TWIST1的表達(dá)和EMT過程。生物信息學(xué)分析表明，TWIST1的3'-UTR含有miRNA-15a-3p和miRNA-16-1-3p兩個結(jié)合位點(diǎn)，miRNA-15a-3p和miRNA-16-1-3p過表達(dá)可以抑制TWIST1基因3'-UTR的熒光素酶活性，下調(diào)N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）和纖維蛋白等EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的活性，從而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[18]。

3 miRNA與轉(zhuǎn)錄因子ZEB

ZEB包括ZEBl和ZEB2兩種類型，二者結(jié)構(gòu)相似，由中間的可變序列將C端和N端的鋅指簇連接起來。C端和N端的鋅指簇能與DNA分子上的CACCT（G）或（C）AGGTG序列結(jié)合，從而抑制其下游EMT相關(guān)蛋白的靶基因轉(zhuǎn)錄[19]。此外，ZEB蛋白還具有Smad結(jié)合域和羧基末端結(jié)合蛋白（C-terminal-binding protein，CtBP）相互作用結(jié)構(gòu)域。研究顯示，ZEB蛋白過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20]，目前已有研究證實(shí)，胃癌組織中存在ZEB的過表達(dá)。ZEB通過下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)表型標(biāo)志物[波形蛋白（vimentin）、纖維粘連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和N-cadherin]和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。一般情況下，miRNA-338-3p在胃癌中過表達(dá)，其通過ZEB2調(diào)控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通道抑制胃癌的EMT過程，沉默miRNA-338-3p可引起胃癌細(xì)胞表型變化，從而調(diào)控N-cadherin、FN和vimentin等EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)[21]。ZEB2作為鈣調(diào)蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制因子，miRNA-145-5p可通過抑制N-cadherin及目的基因ZEB2的表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，調(diào)控胃癌EMT過程[22]。研究顯示，miRNA-200b過表達(dá)可以改變胃癌細(xì)胞的形態(tài)，下調(diào)ZEB2mRNA的表達(dá)，同時上調(diào)鈣調(diào)蛋白的表達(dá)；此外，miRNA-200b過表達(dá)還可以明顯降低腫瘤細(xì)胞增殖率，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[23]。

4 miRNA與轉(zhuǎn)錄因子FOX

叉頭框（forkhead box，F(xiàn)OX）基因家族，是一個龐大且功能廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族，其共同特征是具有一個高度保守的叉頭結(jié)構(gòu)域。研究表明，叉頭框M1（forkhead box M1，F(xiàn)OXMl）蛋白通過調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（ZEBl、ZEB2、snail和Vimentin）的表達(dá)來調(diào)控胃癌細(xì)胞的EMT過程[24]。體外實(shí)驗(yàn)表明，miRNA-345在胃癌組織中低表達(dá)，可抑制胃癌細(xì)胞的EMT過程，而沉默F(xiàn)OXQ1可以逆轉(zhuǎn)miRNA-345對EMT的抑制作用，F(xiàn)OXQ1被證實(shí)是miRNA-345的下游信號蛋白[5]。miRNA-1271在胃癌組織中的表達(dá)下調(diào)，且miRNA-1271的表達(dá)與腫瘤直徑呈負(fù)相關(guān)，與局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較晚的TNM分期密切相關(guān)。miRNA-1271過表達(dá)可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖及EMT過程。敲除FOXQ1可以抑制胃癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，而下調(diào)miRNA-1271的表達(dá)可促進(jìn)FOXQ1表達(dá)的恢復(fù)，因此，F(xiàn)OXQ1被認(rèn)為是miRNA-1271的直接目的基因[25]。此外，miRNA-194在胃癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，其過表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，并調(diào)控胃癌細(xì)胞的EMT表型，miRNA-194可以參與FOXM1轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制[26]。

5 miRNA與其他轉(zhuǎn)錄因子

SP1在胃癌EMT過程中發(fā)揮重要作用，在胃癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常組織[27]。miRNA-223與SP1基因的3'-UTR結(jié)合并抑制其翻譯，采用腫瘤生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞，成功地建立了細(xì)胞EMT模型，miRNA-223過表達(dá)可以促進(jìn)胃癌EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，SP1基因可以特異性調(diào)控miRNA-223/SP1/EMT信號通路抑制胃癌EMT過程[28]。胰島素樣生長因子受體1（insulin-like growth factor receptor 1，IGF1R）致癌基因，是一種細(xì)胞生長的重要調(diào)節(jié)因子，通常在胃癌中過表達(dá)并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的EMT過程，與胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。IGF1R是miRNA-7的直接目的基因，與miRNA-7的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。此外，miRNA-7還可通過調(diào)控IGF1R的表達(dá)，上調(diào)鈣調(diào)蛋白的表達(dá)，部分逆轉(zhuǎn)胃癌EMT的過程。研究顯示，miRNA-7/IGF1R/snail信號通路可抑制胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[29]。胃癌組織中miRNA-148a低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，miRNA-148過表達(dá)可通過下調(diào)vimentin的表達(dá)和上調(diào)鈣調(diào)蛋白的表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其目的基因是轉(zhuǎn)錄因子SMAD2[30]。血清應(yīng)答因子（serum response factor，SRF）也可以調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。研究顯示，SRF在侵襲能力較高的胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平較高，并與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。SRF/miRNA-199a-5p/鈣調(diào)蛋白通路可促進(jìn)胃癌細(xì)胞EMT過程并提高其轉(zhuǎn)移能力[31]。miRNA-144-3p在胃癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，且miRNA-144-3p的表達(dá)水平與腫瘤的浸潤深度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。B淋巴細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)錄因子3（pre-B-cell leukemia transcription factor 3，PBX3）可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的EMT過程，是miRNA-144-3p的直接目的基因。

6 小結(jié)

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和人們對miRNA認(rèn)識的不斷加深，越來越多miRNA的生物學(xué)功能被發(fā)現(xiàn)。部分研究證實(shí)，miRNA具有作為胃癌治療靶點(diǎn)的潛在價值，但其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制仍未十分明確，尚需進(jìn)一步利用miRNA模擬物或拮抗物進(jìn)行更多的體內(nèi)外研究證實(shí)。了解miRNA調(diào)控相應(yīng)靶基因的作用機(jī)制，并據(jù)此對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行基因或藥物靶向治療，可以促使miRNA或靶基因的異常表達(dá)恢復(fù)至正常水平，或降低其異常表達(dá)水平，提高胃癌的診斷、治療水平，改善預(yù)后。