氨基葡萄糖對小鼠實驗性過敏性結膜炎的治療作用△

趙夢帆 李兵

過敏性結膜炎是一種常見的眼表過敏性疾病，主要包括Ⅰ型和Ⅳ型變態(tài)反應[1]。近年來隨著環(huán)境的變化發(fā)病率逐年上升，甚至有報道稱發(fā)病率達到40%，并常伴發(fā)過敏性鼻炎、過敏性哮喘等疾病，對患者日常生活影響較大[2]。因其發(fā)病率高、易反復發(fā)作、治療效果不理想等原因，現(xiàn)已成為眼科難治性疾病之一[3]。目前過敏性結膜炎的治療方法有使用細胞膜穩(wěn)定劑、免疫抑制劑、抗組胺藥物以及特異性免疫治療等，但均不能徹底治愈該病[4]。

氨基葡萄糖是一種天然氨基單糖衍生物，在臨床上常用來治療風濕性及類風濕性關節(jié)炎，也是一種常用的膳食補充劑。近年來，國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖胺有明顯的抗過敏作用，在小鼠過敏性哮喘、過敏性鼻炎、皮炎及小鼠葡萄膜炎等疾病中的作用都得到了證實[5]，但在過敏性結膜炎方面的研究較少，本文旨在研究氨基葡萄糖對小鼠實驗性過敏性結膜炎的治療作用，為過敏性結膜炎的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與分組取6～8周齡雌性Balb/c小鼠40只(40眼)，體質(zhì)量18～22 g(購于錦州醫(yī)科大學)，置于SPF級實驗室飼養(yǎng)；隨機分為5組：空白對照組、過敏性結膜炎組、氨基葡萄糖腹腔注射組、氨基葡萄糖滴眼組、地塞米松治療組，每組8只。

1.1.2主要試劑和儀器氨基葡萄糖鹽酸鹽、卵清蛋白(北京索萊寶生物科技有限公司)，氫氧化鋁佐劑(美國Thermo公司)，地塞米松磷酸鈉滴眼液(武漢五景藥業(yè))，ELISA試劑盒(上海依科賽生物科技公司)；酶標儀、超凈工作臺、裂隙燈顯微鏡。

1.2方法

1.2.1小鼠過敏性結膜炎模型制作從造模開始第0天和第7天，將100 μg卵清蛋白與200 μL氫氧化鋁佐劑按照體積比12的比例完全混合，除空白對照組外，其余各組用混合液進行腹腔注射；第15～18天，給予250 μg的卵清蛋白滴眼激發(fā)。空白對照組在致敏和激發(fā)階段均用等量生理鹽水替代[6-7]。

1.2.2藥物治療及觀察于造模開始后第15～18天，每次滴眼激發(fā)后30 min開始進行藥物干預治療，連續(xù)4 d。其中，氨基葡萄糖腹腔注射組每天1次給予氨基葡萄糖10 mg腹腔注射治療，氨基葡萄糖滴眼組每天4次給予50 mg·mL-1氨基葡萄糖溶液50 μL滴眼治療，地塞米松治療組每天4次給予地塞米松磷酸鈉滴眼液滴眼治療，每天觀察小鼠臨床癥狀。

1.2.3臨床癥狀評估、取材及標本制備末次激發(fā)后30 min內(nèi)，裂隙燈顯微鏡下觀察小鼠眼部臨床癥狀，觀察指標包括結膜水腫、結膜充血、眼瞼充血水腫、流淚及眼部分泌物。用100 g·L-1水合氯醛麻醉后，眼球取血，提取血清用于ELISA檢測；取下小鼠結膜用于制作病理切片并進行HE染色；無菌條件下取小鼠脾臟，分離脾細胞進行培養(yǎng)，檢測上清液中炎癥因子含量。

1.2.4病理學檢測末次激發(fā)后30 min內(nèi)，將眼球連同穹隆部結膜一同取下，40 g·L-1多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，3 μm厚矢狀位連續(xù)切片，每只眼球取不同層面的5張切片進行HE染色，中性樹膠封片，鏡檢。每張切片在400倍光學顯微鏡下隨機觀察5個視野，并進行嗜酸性粒細胞計數(shù)。

1.2.5血清中IgE水平檢測末次激發(fā)后30 min內(nèi)，100 g·L-1水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血，室溫靜置2 h后存于4 ℃冰箱過夜，離心后取上層血清，間接ELISA法測定血清中IgE水平。用已知濃度的標準品繪制標準曲線，加入小鼠血清后室溫靜置2 h，洗板5次，加入生物素標記的抗體和酶結合物的混合液，室溫孵育1 h，洗板5次后，加入顯色底物，避光孵育15 min，加入終止液，混勻后立即在酶標儀450 nm處讀取吸光度(A)值。

1.2.6脾細胞培養(yǎng)及上清液炎癥因子檢測將小鼠脾臟無菌條件下分離，研磨并用無菌濾網(wǎng)過濾，RPMI1640培養(yǎng)基進行重懸，接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，細胞密度為10×106～20×106個·mL-1，每孔50 μL，每孔加入卵清蛋白至終濃度為100 g·L-1。培養(yǎng)96 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測其中IL-4、IL-5、IFN-γ的含量[8-9]。

1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS 21.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1臨床癥狀評估結果末次激發(fā)后30 min，觀察小鼠臨床癥狀?？瞻讓φ战M無明顯的過敏癥狀。過敏性結膜炎組小鼠出現(xiàn)明顯的過敏癥狀，眼瞼嚴重充血水腫，睜眼困難，結膜嚴重充血、水腫，流淚不止，眼部分泌物較多。氨基葡萄糖腹腔注射組、氨基葡萄糖滴眼組和地塞米松治療組小鼠均能觀察到較輕的眼瞼腫脹、結膜少量充血水腫、流淚和少量眼部分泌物。見圖1。

2.2病理學檢測結果高倍鏡下5組小鼠結膜嗜酸性粒細胞計數(shù)，總體差異有統(tǒng)計學意義(F=66.766，P=0.000)。各組間兩兩比較，氨基葡萄糖滴眼組嗜酸性粒細胞數(shù)與地塞米松治療組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；氨基葡萄糖腹腔注射組與氨基葡萄糖滴眼組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。其余各組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。過敏性結膜炎組嗜酸性粒細胞數(shù)均高于其他組。見表1和圖2。

圖1 卵清蛋白滴眼激發(fā)后各組小鼠眼部過敏癥狀。A：空白對照組；B：過敏性結膜炎組；C：氨基葡萄糖腹腔注射組；D：氨基葡萄糖滴眼組；E：地塞米松治療組

圖2 小鼠結膜HE染色(箭頭示嗜酸性粒細胞，×400)。A：空白對照組；B：過敏性結膜炎組；C：氨基葡萄糖腹腔注射組；D：氨基葡萄糖滴眼組；E：地塞米松治療組

2.3血清IgE含量檢測結果各組小鼠血清IgE含量，總體差異有統(tǒng)計學意義(F=1253.780，P=0.000)。各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。過敏性結膜炎組血清IgE含量高于其他各組，氨基葡萄糖滴眼組血清IgE含量低于地塞米松治療組，高于氨基葡萄糖腹腔注射組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。見表1。

2.4脾細胞培養(yǎng)上清液炎癥因子檢測結果各組小鼠間脾細胞培養(yǎng)液上清液中的IL-4、IL-5和IFN-γ的表達水平，總體差異均有統(tǒng)計學意義(F=691.984，P=0.000；F=88.112，P=0.000；F=717.670，P=0.000)。各組間兩兩比較，氨基葡萄糖腹腔注射組上清液IL-5水平與地塞米松治療組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；氨基葡萄糖腹腔注射組、氨基葡萄糖滴眼組、地塞米松治療組及過敏性結膜炎組IFN-γ水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)；過敏性結膜炎組IL-4、IL-5表達水平均高于其余各組；氨基葡萄糖滴眼組IL-4、IL-5表達水平均高于氨基葡萄糖腹腔注射組；空白對照組IFN-γ表達水平均高于其余各組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。見表2。

表1各組小鼠結膜嗜酸性粒細胞數(shù)及血清IgE含量

組別眼數(shù)嗜酸性粒細胞數(shù)/個血清IgE含量/ng·L-1空白對照組87.13±4.05131.41±19.71過敏性結膜炎組844.00±6.97?1028.43±37.03?氨基葡萄糖腹腔注射組820.13±3.04△191.76±23.84△氨基葡萄糖滴眼組819.13±2.90△226.70±25.99△地塞米松治療組818.25±5.18△311.67±36.74△

注：與空白對照組相比，*P<0.01；與過敏性結膜炎組相比，△P<0.01

表2脾細胞培養(yǎng)液上清液中的IL-4、IL-5和IFN-γ表達水平

組別眼數(shù)表達水平/ng·L-1IL-4IL-5IFN-γ空白對照組813.62±5.963.72±0.9333.32±0.54過敏性結膜炎組8279.08±17.7313.34±1.449.56±1.44氨基葡萄糖腹腔注射組8112.12±8.528.08±0.939.55±0.94氨基葡萄糖滴眼組8155.64±8.5010.44±0.979.73±0.85地塞米松治療組851.34±4.468.43±0.959.33±1.53

3 討論

過敏性結膜炎主要包括Ⅰ型和Ⅳ型變態(tài)反應，免疫學機制比較復雜。嚴重的過敏性結膜炎主要由浸潤的嗜酸性粒細胞介導，活化的肥大細胞釋放細胞因子刺激嗜酸性粒細胞脫顆粒產(chǎn)生白三烯、細胞因子等，對組織細胞有毒副作用，引發(fā)組織細胞重大損傷[10]。另外，過敏性結膜炎的發(fā)生發(fā)展還與Th1/Th2細胞因子表達失衡密切相關，表現(xiàn)為Th2型細胞因子優(yōu)勢表達，Th1型細胞因子分泌減少，平衡向Th2方向偏移[11]。Th2型淋巴細胞可以分泌IL-4、IL-5等細胞因子，激活肥大細胞及嗜酸性粒細胞，從而導致過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展[12]。IL-4通過刺激IgE的基因重組和mRNA的轉錄，增強IgE的產(chǎn)生，使免疫系統(tǒng)對小量抗原刺激發(fā)生免疫應答。IL-5通過介導嗜酸性粒細胞的成熟來誘導免疫反應。Th1型淋巴細胞主要產(chǎn)生IFN-γ，IFN-γ是巨噬細胞活化必不可少的抗炎因子，能夠抑制IL-4誘導的IgE的合成，從而參與過敏反應[13-14]。檢測 IL-4、IL-5可以了解Th2的功能狀態(tài)，檢測IFN-γ可以了解Th1的功能狀態(tài)。

目前過敏性結膜炎的治療方法主要有應用細胞膜穩(wěn)定劑、免疫抑制劑、抗組胺藥物以及特異性免疫治療等，單用抗過敏藥物效果不佳且易復發(fā)，激素治療副作用多，長期應用還可能造成嚴重后果。因此，研發(fā)安全有效的抗過敏、抗炎藥物將是治療過敏性疾病的方向之一。

氨基葡萄糖是一種天然氨基單糖衍生物，具有抗炎、抗腫瘤[15]、抗過敏、降脂、降血壓等多重機制，在臨床上是治療風濕性及類風濕性關節(jié)炎的藥物，對許多炎癥和過敏性疾病的多個環(huán)節(jié)都有干預作用[16]。近年來，經(jīng)過國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)，氨基葡萄糖在治療過敏性疾病方面有顯著療效。研究證實，氨基葡萄糖在小鼠過敏性鼻炎中有顯著療效，能有效改善臨床癥狀，顯著降低過敏性鼻炎小鼠體內(nèi)特異性IgE含量[17]。另有研究證明，在過敏性皮炎中氨基葡萄糖也有類似的抗過敏效果[18]。Collins等[19]研究發(fā)現(xiàn)，N-乙酰-D-氨基葡萄糖聚合物可下調(diào)Th2反應。Kim 等[20]報道環(huán)孢霉素/葡萄糖胺聯(lián)合治療有明顯的降低血清IgE和Th2型細胞因子IL-4、IL-5和IL-13的作用，比單用環(huán)孢霉素治療效果更顯著。另外，氨基葡萄糖是一種安全性很高的藥物，對肝功能和胃腸道的損傷很小，而且很少有哮喘惡化或立即過敏的病例發(fā)生[21]。

本研究中，我們將氨基葡萄糖應用于實驗性過敏性結膜炎小鼠，結果顯示過敏性結膜炎組臨床癥狀較空白對照組明顯，結膜嗜酸性粒細胞數(shù)和血清IgE表達水平均較空白對照組明顯增高，說明成功建立了過敏性結膜炎小鼠模型。氨基葡萄糖腹腔注射組和氨基葡萄糖滴眼組臨床癥狀較過敏性結膜炎組輕，結膜嗜酸性粒細胞數(shù)和血清IgE表達水平均顯著低于過敏性結膜炎組，這表明氨基葡萄糖可以改善過敏性結膜炎小鼠的眼部過敏癥狀，降低小鼠體內(nèi)的IgE水平，減輕嗜酸性粒細胞聚集。氨基葡萄糖滴眼組的嗜酸性粒細胞數(shù)與地塞米松治療組相比差異無統(tǒng)計學意義，血清IgE表達水平與地塞米松治療組相比明顯降低，說明氨基葡萄糖滴眼治療在減輕嗜酸性粒細胞聚集和降低血清IgE表達方面有很好的作用，其治療效果優(yōu)于地塞米松。氨基葡萄糖腹腔注射組與氨基葡萄糖滴眼組相比，嗜酸性粒細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，血清IgE表達明顯降低，這表明氨基葡萄糖腹腔注射在降低血清IgE表達方面明顯優(yōu)于滴眼治療，原因可能與藥物的有效濃度相關，需做進一步探討。從小鼠脾細胞培養(yǎng)上清液的檢測結果來看，過敏性結膜炎組脾細胞培養(yǎng)上清液的IL-4、IL-5表達水平相對于空白對照組明顯增高，IFN-γ表達水平相對于空白對照組明顯降低，這提示過敏性結膜炎組中Th1/Th2平衡向Th2方向偏移。氨基葡萄糖腹腔注射組和氨基葡萄糖滴眼組，脾細胞上清液中Th2型細胞因子(IL-4、IL-5)表達水平相對于過敏性結膜炎組明顯降低，但Th1型細胞因子(IFN-γ)表達水平相對于過敏性結膜炎組無明顯改變，提示應用氨基葡萄糖有助于扭轉過敏性結膜炎中Th1/Th2表達失衡，使其重新平衡，從而抑制過敏反應，對過敏性結膜炎起到一定的治療作用，而這種作用主要是通過降低Th2型細胞因子的表達來實現(xiàn)的，對Th1型細胞因子的表達影響不大。

綜上所述，氨基葡萄糖可以明顯改善過敏性結膜炎小鼠的過敏癥狀，減輕結膜嗜酸性粒細胞聚集，降低血清中IgE的表達含量。其作用機制可能是通過降低Th2型細胞因子的表達，進而使過敏性結膜炎中失衡的Th1/Th2表達重新建立平衡而實現(xiàn)的。氨基葡萄糖作為臨床的一種常用藥，有較高的安全性和較低的副作用，有望成為治療過敏性結膜炎的一種新的藥物。