負壓封閉引流干預(yù)創(chuàng)傷后應(yīng)激代謝的實驗研究

陳駕君，楊 帆，解 杰，王 翔，胡 耑，白祥軍

擠壓傷后缺血組織可發(fā)生再灌注損傷和代謝性酸中毒[1]。當(dāng)恢復(fù)再灌注時，如果糾酸過快會導(dǎo)致酸堿(pondus hydrogenii，pH)反常[2]；過慢則會損傷線粒體，加重代謝障礙和酸中毒[3]，從而誘發(fā)“致死性三聯(lián)征”[4]。因此，如何調(diào)控代謝平衡，成為缺血后預(yù)處理(ischemic postconditioning)研究的方向之一[5]。

負壓封閉引流(vacuum sealing drainage，VSD)技術(shù)臨床上可顯著改善擠壓傷預(yù)后[6]。實驗證實，其可通過減輕炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)活性氧含量，改善缺血再灌注損傷[7]，并與糖酵解酶密切相關(guān)[8]。因此，筆者擬通過動物實驗觀察VSD技術(shù)對再灌注后己糖激酶2(hexosekinase，HK2)、磷酸果糖激酶1(Phosphofructokinase1，PFK1)，丙酮酸激酶M1(pyruvate kinase M1，PKM1)、乳酸鹽脫氫酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)、丙酮酸脫氫酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase4，PDK4)，丙酮酸(pyruvic acid，PA)和乳酸(lactic acid，LA)，以及pH值和陰離子間隙(anion gap，AG)值的影響，以探討其保護作用的可能機制。

材料與方法

1實驗動物建模和分組

雄性新西蘭白兔30只，飼養(yǎng)和科學(xué)操作均符合《實驗動物管理條例》。稱重后按照150 mg/kg的劑量，耳緣靜脈注射鹽酸氯胺酮注射液麻醉，按文獻報道[7]制備缺血再灌注損傷模型。將動物隨機分為3組，即假手術(shù)組、缺血再灌注組(I/R組)和VSD干預(yù)的缺血再灌注組(I/R+VSD組)，每組10只。(1)假手術(shù)組動物僅完成左后肢股動靜脈組織游離，為假手術(shù)對照；(2)I/R組動物完成組織游離后進行左后肢股動靜脈的夾閉(6h)及開放(6h)，不進行VSD干預(yù)；(3)I/R+VSD組動物在進行再灌注的同時對損傷處予以VSD(-70kPa，6h)干預(yù)。

2主要儀器、材料和試劑

(1)儀器：Shimadzu LC-10AVP高效液相色譜檢測儀(日本島津株式會社)、GEM Premier 3000全自動血氣分析儀(美國Instrumentation Laboratory公司)；(2)材料：VSD一次性使用負壓引流護創(chuàng)材料(武漢維斯第公司)；(3)試劑：HK2檢測試劑盒(美國Blue gene公司)、PFK1檢測試劑盒(美國Aviva systems biology公司)和PKM1檢測試劑盒(美國Elabscience 公司)；(4)免疫印跡法：LDHA抗體和PDK4抗體(美國Aviva systems biology公司)。

3樣本取材和檢測

(1)糖酵解限速酶：實驗結(jié)束后將兔處死，使用冰去離子水對獲取的骨骼肌組織進行沖洗勻漿，低溫離心機以3 000r/min離心10min，取上清以酶聯(lián)免疫吸附法進行檢測。

(2)糖酵解相關(guān)酶：引入β-actin作為內(nèi)參，采用免疫印跡法檢測。分別于建模時(0)、再灌注前(4h)和實驗結(jié)束后(10h)3個時間點在損傷肌肉同一區(qū)域取材，取漂洗干凈的骨骼肌組織，提取總蛋白進行15% SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉過夜后，依次加入抗體，使用化學(xué)發(fā)光法進行顯色。

(3)糖酵解代謝產(chǎn)物：處死后使用冰去離子水對獲取的組織進行沖洗，取100mg加入0.9%NaCl(含0.5mmol/L EDTA-2Na)和3%HClO4溶液制成10%勻漿液，依次沉淀蛋白、離心、取上清，應(yīng)用高效液相色譜法進行檢測，色譜條件為：5μm，C18柱(3.9mm×150mm)，流動相為95%磷酸鹽緩沖液(PBS)和5%甲醇(MeOH)，調(diào)pH至2.5，等比洗脫，流速為0.8mL/min，檢測波長220nm，柱溫20℃，進樣量10μL。

(4)血氣：分別于建模時、再灌注前、處死前3個時間點，于兔左后肢股動脈處抽取動脈血3mL，應(yīng)用全自動血氣分析儀進行檢測。

4統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

1骨骼肌組織中糖酵解限速酶的變化

與假手術(shù)組比較，I/R組和I/R+VSD組在實驗結(jié)束后測的HK2、PKF1和PKM1均顯著性升高(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+VSD組在實驗結(jié)束后測的各值均顯著性升高(t=2.609，P=0.030；t=2.258，P=0.040和t=1.850，P=0.047)。見表1。

與假手術(shù)組相比：*P<0.05，**P<0.01；與缺血再灌注組相比：ΔP<0.05

2骨骼肌組織中糖酵解相關(guān)酶表達的變化

與假手術(shù)組比較，I/R組和I/R+VSD組在建模時(0h)、再灌注前(4h)和實驗結(jié)束后(10h)LDHA表達相對灰度比分別為1.011±0.007和0.985±0.016、25.492±4.441和24.388±4.663、20.613±4.753和28.177±5.283；而PDK4表達相對灰度比分別為0.997±0.004和1.013±0.009、17.440±3.263和16.998±3.528、15.438±4.125和22.492±6.552；其中，I/R組和I/R+VSD組在再灌注前和實驗結(jié)束后LDHA和PDK4表達顯著性升高(F=2.996，P=0.049和F=18.561，P<0.001，F(xiàn)=4.265，P=0.024和F=26.856，P<0.001)；與I/R組比較，I/R+VSD組實驗結(jié)束后LDHA和PDK4表達顯著性升高(t=2.768，P=0.031和t=3.005，P=0.025)。見圖1。

3骨骼肌組織中糖酵解代謝產(chǎn)物和比值的變化

與假手術(shù)組的PA、LA和LA/PA比值[(0.259±0.044)mmol/L、(2.351±0.303) mmol/L和9.077±0.689]相比較，I/R組和I/R+VSD組在實驗結(jié)束后分別為(0.382±0.033)mmol/L和(0.365±0.047) mmol/L、(5.688±1.153)mmol/L和(4.285±0.937)mmol/L、14.890±1.349和11.740±1.001，均顯著性增高(F=4.221，P=0.025，F(xiàn)=16.482，P<0.001和F=20.480，P<0.001)；與I/R組比較，I/R+VSD組LA和LA/PA比值在實驗結(jié)束后均顯著性降低(t=3.960，P=0.023和t=4.258，P=0.018)。見圖2。

與假手術(shù)組相比：*P<0.05，**P<0.01；與缺血再灌注組相比：ΔP<0.05

與假手術(shù)組相比：*P<0.05，**P<0.01；與缺血再灌注組相比：ΔP<0.05

4外周動脈血中血氣值的變化

與假手術(shù)組比較，I/R組和I/R+VSD組pH值、AG值在處死前顯著性變化(F=2.260，P=0.040和F=2.562，P=0.032)，但是I/R組和I/R+VSD組之間無顯著性差異(t=1.446，P=0.166和t=1.333，P=0.263)。見表2。

表2 外周動脈血中血氣值的變化

與假手術(shù)組相比：*P<0.05，**P<0.01

討論

擠壓傷是多發(fā)傷的常見傷[9]，而缺血再灌注損傷是骨骼肌繼發(fā)損傷的主要原因[10]。有研究證實[11-12]，長時間能量缺乏會導(dǎo)致線粒體腫脹和細胞壞死，迫使機體采取糖酵解應(yīng)激代謝為細胞供能[13]，其中HK2、PFK1和PKM1是其限速酶，而PDK4則可通過磷酸化限制PA的完全氧化，經(jīng)LDHA轉(zhuǎn)化成為LA以保證ATP的合成[14]。而組織中LA/PA比值、外周血中的pH值和AG值則可以反映局部和全身代謝性酸中毒的程度。

本實驗結(jié)果顯示：(1)糖酵解關(guān)鍵酶：與假手術(shù)組比較，I/R組和I/R+VSD組在實驗結(jié)束后的糖酵解關(guān)鍵酶均顯著性升高，證實缺血缺氧可上調(diào)酶表達，利于應(yīng)激狀態(tài)下為細胞供能；而I/R+VSD組酶的上調(diào)更明顯；(2)糖酵解相關(guān)酶：與假手術(shù)組比較，I/R組和I/R+VSD組在再灌注前和實驗結(jié)束后LDHA和PDK4表達顯著性升高，而I/R+VSD組的表達更高提示負壓可以促進上述酶的表達；(3)局部和全身酸中毒指標：①組織內(nèi)：與假手術(shù)組比較，I/R組和I/R+VSD組PA、LA和LA/PA比值在實驗結(jié)束后均顯著性增高，提示酸性代謝產(chǎn)物隨著糖酵解增多，堆積在組織內(nèi)形成局部酸中毒；而I/R+VSD組在實驗結(jié)束后上述值均顯著性降低，可能與VSD技術(shù)改善局部循環(huán)加快轉(zhuǎn)運有關(guān)；②外周血：與假手術(shù)組比較，雖然I/R組和I/R+VSD組pH值、AG值在處死前有顯著性變化，但是I/R組和I/R+VSD組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這與全身強大的酸堿平衡調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上，VSD技術(shù)通過上調(diào)糖酵解酶的表達，改善應(yīng)激狀態(tài)時細胞的能量代謝和供給，減少了局部酸中毒和pH反常的發(fā)生，對機體起到保護作用。本研究為今后通過調(diào)節(jié)負壓吸引的強度和時間以干預(yù)缺血后預(yù)處理提供了理論依據(jù)。