川芎嗪干預(yù)慶大霉素耳毒性作用的機理研究

王晨露 王永華 王一鳴 鄭華平 李文靖

氨基糖苷類藥物(aminoglycoside antibiotics，AmAn)是目前臨床上治療革蘭陰性桿菌和結(jié)核桿菌感染的一種藥物，該藥物因其性質(zhì)穩(wěn)定、殺菌力強、價格低廉等優(yōu)點為臨床常用藥。然而氨基糖苷類藥物的腎毒性、耳毒性使其在臨床應(yīng)用中受到限制[1]。因此對氨基糖苷類藥物引起的耳毒性損失進行積極的防治，及早干預(yù)頗為重要。川芎嗪是川芎的重要成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲苦吡嗪?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為川芎嗪具有抗自由基、改善微循環(huán)、保護血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用，能夠通過血-迷路屏障進入耳蝸外淋巴液，直接作用于耳蝸和聽神經(jīng)，從而發(fā)揮改善內(nèi)耳微循環(huán)的功效[2]。川芎嗪防治慶大霉素藥物耳毒性作用機理的研究，近年來取得不少進展，闡述機理的學(xué)說很多但其機制仍不十分明確。本研究在建立慶大霉素藥物性耳聾動物模型的基礎(chǔ)上觀察致聾耳蝸各細(xì)胞的凋亡情況，檢測JNK的mRNA表達情況。試圖通過本研究，從病理層面及基因水平上，探討川芎嗪干預(yù)慶大霉素耳毒性作用的防治機理。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及實驗分組

健康活潑、無耳疾、耳廓反射靈敏的白毛紅目豚鼠36只，雌雄各半，體重260～310 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。隨機分成3組：生理鹽水組（Ⅰ組）12只，慶大霉素造模組（Ⅱ組）12只，川芎嗪防治組（Ⅲ組）12只。

1.2 主要藥品與試劑

硫酸慶大霉素注射劑：浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司，批號：20111215，規(guī)格：8萬單位/支；注射用鹽酸川芎嗪：哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號：110505A2，規(guī)格40 mg/支；細(xì)胞凋亡試劑盒（Roche公司）；β-Actin： Boster公司，批號：BM0627。

1.3 主要儀器

NGT-Ⅱ型腦干誘發(fā)電位儀：中國科技大學(xué)生物技術(shù)有限公司；熒光顯微鏡（OLYMPUS BX60型）：olympus公司；HPIAS-1000病理圖文分析系統(tǒng)：中國武漢同濟千屏影像工程公司；MICROW HM34OE石蠟切片機：德國；臺式高速冷凍離心機5417R：德國Eppendorf公司；定量PCR儀器：ABI 7500。

1.4 給藥方法

36只豚鼠隨機分為3組，即生理鹽水組（Ⅰ組）、慶大霉素造模組（Ⅱ組）、川芎嗪防治組（Ⅲ組）。Ⅰ組（12只）肌注與慶大霉素等量的生理鹽水，連續(xù)12天；Ⅱ組(12只)肌注硫酸慶大霉素120 mg·kg-1·d-1，連續(xù)12天；Ⅲ組(12只)肌注硫酸慶大霉素120 mg·kg-1·d-1及腹腔注射鹽酸川芎嗪30 mg·kg-1·d-1，連續(xù)12天[3]。

2 觀測指標(biāo)

2.1 聽性腦干反應(yīng)（ABR）測試

動物麻醉后，在聲電屏蔽室內(nèi)采用NGT-Ⅱ型腦干誘發(fā)電位儀進行測試。電極放置：記錄電極置顱頂正中，參考電極及接地電極分置于給聲耳及對側(cè)耳后皮下。各電極除針尖部留出10 mm刺入皮下，余均外套硅膠絕緣套。刺激參數(shù)及測試參量：刺激聲為濾波短聲(click)，帶通濾波100～3000 Hz，疊加512次，掃描時程10 ms，F(xiàn)DH－39型耳機輸出，重復(fù)率10次/秒，距離豚鼠耳道口0.5 cm。以Ⅲ波為基準(zhǔn)確定反應(yīng)閾[4]。測試時間：動物分別在實驗前、處死前進行ABR測試。

2.2 原位凋亡細(xì)胞檢測-TUNEL法及圖像處理

按TUNEL試劑盒說明書對含內(nèi)耳的豚鼠顳骨組織的石蠟切片進行標(biāo)記染色，熒光顯微鏡（OLYMPUS BX 60型）下觀察，結(jié)果判斷：陽性細(xì)胞核呈黃色或棕色，陰性細(xì)胞核呈藍色。每次均設(shè)立陽性及陰性對照。陽性對照選擇惡性淋巴瘤標(biāo)本；陰性對照TUNEL反應(yīng)液中不含TdT酶。對每張切片的陽性細(xì)胞的著色強度采用HPIAS-1000病理圖文分析系統(tǒng)進行測量[5]。每張切片采集螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、螺旋器和側(cè)壁（血管階）3個視野（×200倍）分別測量，經(jīng)過該系統(tǒng)分析記錄該個視野的免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的平均光密度，得出積分光密度值（integral optical density，IOD）并對IOD數(shù)值進行整理及統(tǒng)計分析[4]。

2.3 Real-time PCR法檢測JNK的mRNA含量

采用Primer 5.0引物設(shè)計軟件和引物設(shè)計原則進行PCR引物的設(shè)計，將豚鼠右側(cè)耳蝸標(biāo)本從-80℃冰箱中取出，液氮研磨，加入預(yù)冷過的TRIZOl試劑300 ul混勻，室溫放置5 min。加入氯仿0.2 ml，用力振搖，室溫放置2～3 min。在4℃最大轉(zhuǎn)速12000 rpm離心15 min，吸取上層水相，移至另一離心管。加入0.5 ml異丙醇，混勻，室溫靜置10 min。4℃最大轉(zhuǎn)速12000 rpm離心10 min，棄上清液。加入75%預(yù)冷乙醇，用乙醇1 ml清洗試管，倒扣吸水紙上，打開排風(fēng)扇，靜止15 min。加入30 ul DEPC水于靜置的離心管中，馬上進行吹打，吹打時應(yīng)注意避免產(chǎn)生氣泡，得RNA。短暫離心，依次加入：反復(fù)5次第一鏈反應(yīng)緩沖液2 μl、Oligo dT引物0.5 μl、逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl、總RNA2 μl，采用DEPC水補齊到10 μl?；靹蚝髮⒒旌衔锓胖迷?7℃中20 min。85℃加熱15 s終止反應(yīng)，冷凍保存。逆轉(zhuǎn)錄完畢后得cDNA。94℃ 5 min，再將反應(yīng)條件變?yōu)?4℃15 s，60℃45 s，循環(huán)擴增40次。60℃檢測熒光值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對各種數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩樣本比較，計量資料采用獨立樣本t檢驗，多個樣本間比較，正態(tài)分布采用單因素方差分析，P＜0.05為差別有統(tǒng)計意義。

4 結(jié)果

4.1 ABR閾值檢測

各組click ABR檢測結(jié)果如表1所示，實驗前各組豚鼠click ABR閾值無顯著性差異（P＞0.05）。連續(xù)用藥12天后，各組豚鼠click ABR閾值間的差別有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗后慶大霉素造模組和川芎嗪組的聽閾顯著性升高，與生理鹽水組相比（P＜0.01）；川芎嗪防治組閾值雖有升高，但明顯低于慶大霉素造模組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

4.2 不同實驗組耳蝸各細(xì)胞凋亡的影響

4.2.1 螺旋神經(jīng)節(jié)（spiral ganglion cells，SGC）部位Ⅰ組SGC部位未見TUNEL染色陽性細(xì)胞。Ⅱ組可見大量藍紫色陽性細(xì)胞。Ⅲ組可見不同程度的染色陽性細(xì)胞，與Ⅰ組相比，IOD值差異有極顯著性（P＜0.001），提示慶大霉素能誘導(dǎo)豚鼠耳蝸SGC細(xì)胞凋亡。與Ⅱ組相比較，Ⅲ組IOD值有顯著性差異(P＜0.05)，提示川芎嗪具有拮抗慶大霉素耳損傷的作用。

表1 實驗前后各組豚鼠click ABR閾值比較（dB nHL，±s）

表1 實驗前后各組豚鼠click ABR閾值比較（dB nHL，±s）

與同組實驗前相比，▲P ＜0.0 1；與實驗后I 組相比，△P＜0.01；與實驗后Ⅱ組相比，*P＜0.01；Ⅱ組豚鼠死亡2只，實驗后無法行ABR測試，故剔除

±s）實驗前 實驗后I組 24 4.23±4.00 5.77±6.07*Ⅱ組 20 4.67±5.50 49.67±22.40▲△Ⅲ組 24 3.86±4.35 32.73±19.07▲△*組別 N(耳) click ABR閾值（dB nHL，

4.2.2 螺旋器部位Ⅰ組螺旋器未見染色陽性細(xì)胞。Ⅱ組可見大量陽性細(xì)胞，與Ⅰ組比較具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。Ⅲ組陽性細(xì)胞均不同程度增加，與Ⅰ組比較，有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，與Ⅱ組比較，具有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001），提示川芎嗪可以拮抗慶大霉素對耳蝸毛細(xì)胞凋亡的影響。

4.2.3 側(cè)壁：Ⅰ組側(cè)壁染色為陰性。Ⅱ組有大量染色陽性細(xì)胞，與Ⅰ組比較，差異有極顯著性（P＜0.001），Ⅲ組側(cè)壁TUNEL染色均有不同程度的增加，與Ⅰ組比較均有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，與Ⅱ組比較，差異具有極顯著性（P＜0.001），提示慶大霉素耳毒性影響側(cè)壁血管紋部位，川芎嗪可拮抗慶大霉素帶來的耳損傷。詳見表2。

4.3 Real-time PCR檢測結(jié)果

實驗后Ⅱ組與Ⅰ組、Ⅲ組相比，JNK/β-actin mRNA表達量明顯升高（P＜0.05），但Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組兩兩之間差值無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明川芎嗪可以明顯降低JNK通路在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的表達。

5 討論

慶大霉素引起耳蝸損失的機制有很多學(xué)說，其中代謝異常、氧化損傷、微循環(huán)障礙等最終導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡的機制得到多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可[6，7]。耳蝸是產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的代謝組織，在正常情況下線粒體代謝產(chǎn)生的ROS可被機體內(nèi)部的抗氧化機制清除，但慶大霉素在一定時間范圍內(nèi)隨著用藥時間的延長，致使耳蝸產(chǎn)生的自由基含量增加，過量的自由基難以被正常的防御機制所清除，作用于生物膜上的多不飽和脂肪酸而誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，從而使生物膜完整性被破壞，通透性增加，促使細(xì)胞崩解破裂、死亡[8]。本研究基于ROS可通過JNK信號通路調(diào)控耳蝸毛細(xì)胞凋亡，來補充慶大霉素耳毒性作用的機制。

表2 三組豚鼠耳蝸細(xì)胞凋亡TUNEL積分光密度值(IOD)

表3 實驗后各組豚鼠耳蝸JNK/β-actin mRNA表達

c-Jun氨基末端激酶信號通路即JNK信號通路是細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)的通路之一，其中JNK促進細(xì)胞凋亡的機制：①通過上調(diào)促凋亡蛋白的表達而啟動死亡受體途徑的細(xì)胞凋亡[9～11]；②作用于線粒體，激活的caspase-3與凋亡底物結(jié)合引起線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[12]。目前已有Ylikoski[13]和Wang[14]等分別報道，應(yīng)用JNK的抑制劑可顯著抑制慶大霉素誘導(dǎo)的離體培養(yǎng)的毛細(xì)胞的凋亡，也有研究表明，川芎嗪可通過抑制JNK通路相關(guān)蛋白c-fos、c-Jun，p-JNK的表達來降低缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)海馬祌經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死[15]。因此本研究通過檢測JNK mRNA的轉(zhuǎn)錄情況，試圖基于此來探討川芎嗪對慶大霉素耳毒性的干預(yù)機制。

本研究利用Real-time PCR法測mRNA轉(zhuǎn)錄水平，慶大霉素造模組的JNK/β-actin mRNA表達量明顯升高（P＜0.05），但兩兩組間（生理鹽水組、慶大霉素造模組、川芎嗪防治組）差值無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明川芎嗪可以明顯降低JNK在基因水平上的表達。本研究結(jié)果表明川芎嗪雖不能完全拮抗慶大霉素造成的耳損害，但服用川芎嗪防治后各項指標(biāo)均有所改善，可明顯降低慶大霉素導(dǎo)致的JNK轉(zhuǎn)錄水平上的高表達，從而有效防治慶大霉素的耳毒性，這可能是川芎嗪發(fā)揮防治作用的機制之一。