Akt抑制劑MK-2206對肝癌細胞huh7生物學(xué)行為的影響及機制

熊琳 何曉琴 范黎 徐細明

[摘要] 目的 探討MK-2206作用于肝癌細胞huh7后對其生物學(xué)行為的影響及作用機制。 方法 體外培養(yǎng)人肝癌細胞系huh7，采用不同濃度（0、2.5、5、10、20、40 μmol/L）MK-2206干預(yù)huh7細胞。采用CCK-8檢測細胞增殖變化;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的變化;蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達。 結(jié)果 與對照組（0 μmol/L）比較，MK-2206對肝癌細胞huh7的增殖活性有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性和時間依賴性（P < 0.05）;MK-2206誘導(dǎo)huh7細胞凋亡（P < 0.05），顯著抑制Akt的蛋白表達（P < 0.05）。 結(jié)論 Akt抑制劑MK-2206可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路來調(diào)控肝癌細胞huh7的生物學(xué)行為。

[關(guān)鍵詞] 肝癌;PI3K/Akt信號通路;MK-2206;增殖;遷移;凋亡

[中圖分類號] R735.7? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0008-05

肝癌是世界第六大常見癌癥，也是發(fā)生癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，近年來其發(fā)病率及死亡率仍呈上升趨勢[1]。我國肝癌患者人數(shù)占全世界肝癌患者的55%[2]。手術(shù)切除是肝癌的首選治療方法，但肝癌發(fā)病隱匿，惡性程度高，進展速度快，根治性手術(shù)僅可用于不足30%的患者[3]。因此，系統(tǒng)性治療在中晚期肝癌患者的治療中扮演著重要角色。傳統(tǒng)的化療方法副作用大，療效不佳，易耐藥[4]。分子靶向藥物索拉非尼可改善中晚期肝癌患者生存期，但其僅可延長總體生存期數(shù)月[5-6]。目前，迫切需要開發(fā)出新的靶向治療藥物。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要靶點，該通路在調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及自噬等方面中具有重要作用[7]，有望成為新的惡性腫瘤治療靶點。MK-2206是一種人工合成的Akt特異性變構(gòu)抑制劑，可有效抑制多種惡性腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，具有良好的抗腫瘤活性[8-9]。本研究以肝癌細胞huh7為研究對象，探討MK-2206的抗肝癌作用及其可能的作用機制，以期為其抗腫瘤研究和臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器? 超凈工作臺（美國AIRTECH）;CO2細胞培養(yǎng)箱（德國Binder）;普通及倒置顯微鏡（日本Olympus）;離心機（德國Thermo）;流式細胞儀（美國Bio-Rad）;酶標(biāo)儀（美國PerKin Elmer）;超低溫冰箱（New Brunswick Scientific）、電熱恒溫干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）;SDS-PAGE電泳（北京六一生物科技有限公司）;Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR）等。

1.1.2 試劑? DMEM（美國Gibco公司）;胎牛血清（美國Gibco公司）;青鏈霉素（美國Hyclone）;胰蛋白酶-EDTA（美國Hyclone）;胰蛋白酶（美國Hyclone），MK-2206（selleck公司）;CCK-8試劑（日本Dojindo）;細胞凋亡試劑盒（美國Bio-rad）;BCA蛋白定量試劑盒（美國Sigma）;蛋白上樣緩沖液（日本Takara）;蛋白Marker（日本Takara）;蛋白抗體（美國Abcam）等。

1.1.3 細胞系? 人肝癌細胞huh7細胞購自上海中國科學(xué)院細胞庫。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與傳代? 將huh7細胞接種于含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，每2 d為細胞更換培養(yǎng)液1次。于顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，待細胞生長到覆蓋瓶底70%～80%面積時，可進行傳代接種。棄瓶內(nèi)的培養(yǎng)基，用1 mL胰酶均勻覆蓋瓶底，在培養(yǎng)箱孵育1～2 min，待細胞收縮變圓，用培養(yǎng)基終止消化，離心，棄上清，按1∶3傳代，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8細胞生長抑制率檢測? 取對數(shù)生長期的huh7細胞，0.5%胰酶消化1 min后，RT 1000 g/min離心5 min，重懸培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度為5×105/mL，接種于3塊96孔板，每孔加入上述細胞懸液100 μL。待細胞貼壁后加入MK-2206，使藥物終濃度分別為2.5、5、10、20和40 μmol/L，每種濃度組以及陰性對照組均設(shè)5個復(fù)孔。分別在加藥后24、48、72 h后加入CCK-8（10 mg/mL）10 μL，于37℃培養(yǎng)箱孵育30 min～1 h，以490 nm為檢測波長，用酶標(biāo)儀讀取吸光度，取5個復(fù)孔的平均值。上述實驗重復(fù)3次。抑制率=1-（OD加藥孔-OD調(diào)零孔）/（OD對照孔-OD調(diào)零孔）。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率? 收集不同藥物濃度（0、2.5、5、10、20和40 μmol/L）處理24 h后的huh7細胞，收集原培養(yǎng)基，用0.5%不含EDTA的胰蛋白酶0.5 mL消化各孔，30 s～1 min后終止消化，將原培養(yǎng)基和消化液一同離心，RF 2000 g/min離心5 min。其后，棄上清，用2 mL 4℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）懸浮細胞，2000 g/min，離心5 min。重復(fù)上述步驟一次，棄PBS，加入100 μL Binding buffer，加入5 μL異硫氰酸熒光素（FITC），渦旋混勻后，加入10 μL碘化丙啶（PI），室溫避光孵育5 min，再補充加入400 μL Binding buffer后上機檢測。上述實驗重復(fù)3次。細胞總凋亡率=早期凋亡率（Annexin+/PI-）+晚期凋亡率（Annexin+/PI+）。

1.2.4 Western blot測蛋白表達量差異? 取對數(shù)生長期huh7細胞，接種于6孔板，待細胞貼壁24 h后，用不同藥物濃度（0、2.5、5、10、20和40 μmol /L）處理24 h。加入 4℃預(yù)冷的細胞裂解緩沖液100 μL后，冰上作用30 min。用細胞刮刀刮取細胞碎片和裂解產(chǎn)物，移入1.5 mL離心管。用超聲波細胞粉碎機粉碎上述產(chǎn)物后，4℃ 12 000 g/min高速冷凍離心20 min。BCA檢測法檢測蛋白濃度，用細胞裂解緩沖液調(diào)整各組間的蛋白濃度，使其一致，加入上樣緩沖液，100℃加熱5 min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）凝膠電泳，將分離后蛋白電泳轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜3次后分別加入一抗（Akt、p-Akt、β-catenin及GAPDH）4℃搖床過夜孵育12 h，而后洗膜3次，加入二抗于搖床作用1 h，再次洗膜3次，于Odyssey上掃膜，并計算灰度值。上述實驗重復(fù)3次。相對灰度值=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，等級資料比較用秩和檢驗;計數(shù)資料用率表示，組間比較采用成組χ2檢驗，多組間比較采用方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MK-2206對huh7的生長抑制作用

CCK-8實驗結(jié)果表明，不同濃度MK-2206處理huh7細胞24、48、72 h后均能抑制細胞生長增殖，且抑制效應(yīng)呈時間和濃度依賴性。MK-2206的24、48、72 h的半抑制濃度（IC50）分別為5.467、2.961、1.924 μmol/L。當(dāng)藥物濃度達到40 μmol/L時，在不同藥物作用時間下均可使huh7幾乎全數(shù)死亡。見圖1。

2.2 MK-2206對細胞凋亡的影響

取MK-2206濃度0、2.5、5、10、20和40 μmol/L，作用huh7細胞24 h后，利用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，除外2.5 μmol/L，與空白對照組（0 μmol/L）比較，其余各濃度組的凋亡率明顯升高，且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2、表1。當(dāng)藥物濃度達到40 μmol/L時，鏡下觀察，huh7細胞幾乎全數(shù)死亡，流式圖中呈現(xiàn)單一細胞團。其后增設(shè)濃度組，即取0、2.5、5、10、20、25、30、35和40 μmol/L作用于huh7細胞24 h后檢測細胞凋亡情況。結(jié)果當(dāng)藥物濃度達到30 μmol/L，即出現(xiàn)huh7細胞大量凋亡。見圖2A。

2.3 MK-2206對Akt/PI3K/mTOR信號通路的影響

藥物濃度達40 μmol/L時，huh7細胞出現(xiàn)大量凋亡，其提取所得蛋白的濃度過低，無法顯示出蛋白條帶。Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組（0 μmol/L）比較，Akt蛋白表達水平隨MK-2206的濃度升高而顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;與空白對照組比較，p-Akt蛋白水平表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3。

3 討論

肝癌的發(fā)生率及死亡率呈上升趨勢，是我國沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。目前的治療方式使患者獲益有限，急需探索新的治療方式[10]。PI3K/Akt在多種腫瘤中高表達，參與腫瘤的惡性進展，同時在肝癌惡性進展及化療耐藥中起到重要的作用[11-12]。Akt作為PI3K的下游靶蛋白，是PI3K/Akt信號通路的核心靶點。因此，通過調(diào)控Akt表達可調(diào)整細胞增殖和凋亡的平衡，進而抑制腫瘤生長[13]。MK-2206可促進急性髓性白血病細胞的凋亡，并且增加阿糖胞苷的細胞毒性[14]。MK-2206可通過抑制MAPK信號通路抑制胃癌細胞生長[15]。同時，MK-2206也抑制結(jié)腸癌腫瘤干細胞的增殖[16]。在臨床研究中，MK-2206也展示出了良好的治療效果[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，MK-2206可以抑制huh7細胞的增殖，且抑制效應(yīng)呈濃度和時間依賴性;MK-2206可以促進huh7細胞的凋亡，且呈濃度依賴性。MK-2206可通過抑制huh7中的PI3K/Akt信號通路來發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究的不足之處：①實驗對象單一，缺乏體外實驗，后期可以對具有高侵襲能力的肝癌細胞系開展相關(guān)研究;②本研究只對PI3K/Akt信號通路上的關(guān)鍵蛋白進行了蛋白表達水平的驗證，缺乏對這兩條通路的下游靶蛋白表達水平的驗證;③本研究缺少凋亡相關(guān)蛋白的表達水平的驗證。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)Akt抑制劑MK-2206通過抑制PI3K/Akt信號通路促進肝癌細胞系huh7的凋亡，從而達到抑制腫瘤生長的目的。后期可進一步完善MK-2206對肝癌細胞抗腫瘤作用的研究。

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（收稿日期：2018-06-06? 本文編輯：王? ?蕾）