蘆根提取物與葦根提取物HPLC特征圖譜的比較

譚麗容，周楚娟，程敏，黃月純，張龍開，魏剛，王雅文

[1.無限極(中國)有限公司，廣東 江門 529156； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405； 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405； 4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006]

蘆根(PhragmitisRhizoma)是禾本科植物蘆葦PhragmitescommunisTrin. 的新鮮或干燥根莖，性寒味甘，具有清熱瀉火、生津止嘔、除煩、利尿的功效，用于熱病煩渴、肺熱咳嗽、肺癰吐膿、胃熱嘔噦、熱淋澀痛[1]。其酚酸類成分主要包括對香豆酸、阿魏酸等[2-3]，具有清熱、止嘔、抗菌消炎的作用[4-7]。蘆根提取物是蘆根藥材采用適宜的工藝制備而成，目前已被某些保健品作為原料，如促進(jìn)排鉛的清基茶，輔助降血糖的綠源膠囊等[8]。葦根(ZizaniaecaducifloraeRhizoma)收載于廣東省中藥飲片炮制規(guī)范中，又名葦莖、野茭筍根、菰根、金葦根、菰蔣根，為禾本科植物茭筍Zizaniacaduciflora(Turcz.ex Trin.)Hand.-Mazz.的干燥根狀莖，具有清熱化痰、透表、除煩止渴的功效，用于久熱不退、肺熱咳嗽、煩渴、小兒隱疹不退、感冒發(fā)熱、咳嗽。它是廣東歷來藥用及出口的習(xí)銷商品，在湖北、云南等省也有使用，分別稱為金葦根、茭白根，主要用于治肺熱咳嗽[9]。因名稱、性狀及藥效上與蘆根的相似性，常與蘆根互相替補(bǔ)使用或混淆使用[10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，葦根藥材與蘆根藥材具有較為類似的酚酸類成分，但藥材制成提取物后，其化學(xué)成分如何，尚不明確。目前葦根提取物尚無法定標(biāo)準(zhǔn)，亦鮮有質(zhì)量研究報(bào)道。因此，本研究采用HPLC特征圖譜的分析技術(shù)，比較蘆根提取物與葦根提取物HPLC特征圖譜的差異，為蘆根提取物質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

HP1200型高效液相色譜儀(包括二極管陣列檢測器，美國Agilent 公司)，KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

10批蘆根提取物來源于4個(gè)廠家，信息詳見表1。10批葦根藥材經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)魏剛研究員鑒定為禾本科植物茭筍Zizaniacaduciflora(Turcz.ex Trin.) Hand.-Mazz.的干燥根狀莖，詳見表1。葦根提取物由適量藥材加20倍量水煎煮3次，合并濾液，濃縮至稠膏，加適量輔料混勻，65 ℃減壓干燥而得。

對香豆酸對照品(批號BCBS872，Sigma Aldrich公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%)；阿魏酸對照品(批號111073-201604，中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%)；乙腈為色譜純，德國Merck 公司；其他試劑均為分析純，水為純化水。

表1 蘆根提取物與葦根提取物樣品的來源 Table 1 The sources of Phragmitis Rhizoma extract and Zizaniae caduciflorae Rhizoma extract

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流動(dòng)相為乙腈-0.5%KH2PO4(pH=2.15)，梯度洗脫：0～15 min，7%A；15～35 min，7%A→12%A；35～55 min，12%A→15%A；55～70 min，A為15%A→19%A；70～80 min，19%A→22%A；80～85 min，22%A。進(jìn)樣量為15 μL；檢測波長為275 nm；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min。

2.2 供試品溶液的制備

取提取物粉末0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇50 mL，超聲提取60 min，取出，放冷，濾過，蒸干。殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3 混合對照品溶液的制備

分別取對香豆酸、阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含對香豆酸、阿魏酸分別22.2、10.6 μg的混合溶液，搖勻，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品(LG2)溶液15 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下方法測定，結(jié)果所測的特征圖譜與所得的對照圖譜相似度均大于0.99，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品(LG2)溶液15 μL，分別在0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下方法測定，結(jié)果所測的特征圖譜與對照圖譜相似度均大于0.99，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(LG2)6份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，結(jié)果所測的特征圖譜與所得的對照圖譜相似度均大于0.99，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 樣品測定

分別取10批蘆根提取物、10批葦根提取物樣品，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別精密吸取混合對照品、供試品溶液15 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。

2.6 蘆根提取物與葦根提取物特征圖譜的比較分析

2.6.1 蘆根提取物特征圖譜的建立與分析 對香豆酸、阿魏酸混合對照品溶液的HPLC色譜圖見圖1。10批蘆根提取物主要特征峰基本一致，重疊圖見圖2。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版)”(以下簡稱“相似度軟件”)生成的對照圖譜，共標(biāo)示出7個(gè)特征峰，見圖5。蘆根提取物1(LG1)的7個(gè)特征峰的紫外光譜圖見圖3。以峰6(對香豆酸)作為參照峰，計(jì)算各特征峰相對保留時(shí)間及相對峰面積，結(jié)果見表2。

t/min72.2030.22-11.76mAU0.0012.3224.6436.9649.2861.6073.9286.2412

1.對香豆酸； 2.阿魏酸。

圖1對香豆酸、阿魏酸混合對照品溶液的HPLC色譜圖

Figure1HPLC chromatogram of the mixed referencesp-coumaric acid and ferulic acid

436.40327.20218.00108.80-0.40mAU12.3224.6436.9649.2861.6073.9286.240.00t/minS10S9S8S7S6S5S4S3S2S1

S1～S10.表1中LG1～LG10。

圖210批蘆根提取物的HPLC特征圖譜

Figure2HPLC characteristic spectra of the 10 batchesPhragmitisRhizomaextract

2.6.2 葦根提取物特征圖譜的建立與分析 10批葦根提取物樣品能檢出與蘆根提取物一致的7個(gè)特征峰，但比蘆根提取物多6個(gè)黃酮紫外光譜特征的特征峰(峰w1～w6)。不同批次主要特征峰基本一致，重疊圖見圖4。將10批樣品特征圖譜用相似度軟件生成對照圖譜，見圖5。葦根提取物樣品WG1的6個(gè)黃酮特征峰的紫外光譜圖見圖6。以峰6(對香豆酸)作為參照峰，計(jì)算各特征峰相對保留時(shí)間及相對峰面積，結(jié)果見表3。

12.5107.552.50mAU12.5107.552.506420mAU806040200864203020100121086420250300350400250300350400250300350400250300350400250300350400250300350400250300350400峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7λ/nmλ/nmλ/nmλ/nm

圖3蘆根提取物(LG1)特征峰的紫外光譜圖

Figure3Ultraviolet spectra of characteristic peaks ofPhragmitisRhizomaextract(LG1)

表2 10批蘆根提取物HPLC特征峰的平均相對保留時(shí)間及相對峰面積Table 2 Relative retention time and relative peak area of HPLC characteristic peaks of Phragmitis Rhizoma extract

186.79124.4362.07-0.29mAU12.3224.6436.9649.2861.6073.9286.240.00t/minS10S9S8S7S6S5S4S3S2S1

S1～S10. 表1中WG1～WG10。

圖410批葦根提取物的HPLC特征圖譜

Figure4HPLC characteristic spectra of the 10 batchesZizaniaecaducifloraeRhizomaextract

2.6.3 蘆根提取物與葦根提取物特征圖譜的比較分析 分別將10批蘆根提取物、10批葦根提取物的HPLC圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入相似度軟件，對照圖譜的生成方法為均值數(shù)法，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1，運(yùn)用多點(diǎn)校正方法對各色譜峰進(jìn)行全峰匹配，生成特征圖譜對照模式。10批蘆根提取物、10批葦根提取物的HPLC圖譜分別以生成的蘆根提取物、葦根提取物對照圖譜(分別為S1、S2)為對照，進(jìn)行相似度計(jì)算，相似度結(jié)果見表4。

12.3224.6436.9649.2861.6073.9286.240.00t/min130.6487.0543.47-0.12mAU123456(S)71234567S1w1w2w3w4w5w6S2

6.對香豆酸； 7.阿魏酸。

圖5蘆根提取物(S1)、葦根提取物(S2)的對照圖譜

Figure5HPLC characteristic spectra ofPhragmitisRhizomaextract (S1)andZizaniaecaducifloraeRhizomaextract(S2)

806040200250300350400峰w1λ/nm403020100250300350400峰w4403020100250300350400峰w2121086420250300350400峰w314121086420250300350400峰w6λ/nm20151050250300350400峰w5λ/nmmAUmAU

圖6葦根提取物(WG1)6個(gè)特征峰(w1～w6)的紫外光譜圖

Figure6Ultraviolet spectra of HPLC characteristic peaks (w1-w6)ofZizaniaecaducifloraeRhizomaextract(WG1)

表3 10批葦根提取物HPLC特征峰的平均相對保留時(shí)間及相對峰面積Table 3 Relative retention time and relative peak area of HPLC characteristic peaks of Zizaniae caduciflorae Rhizoma extract

表4 10批蘆根提取物、10批葦根提取物HPLC特征圖譜的相似度結(jié)果

Table4The similarities of HPLC characteristic spectra ofPhragmitisRhizomaextract andZizaniaecaducifloraeRhizomaextract

批號相似度批號相似度LG10.980WG10.857LG20.974WG20.941LG30.977WG30.907LG40.999WG40.807LG50.992WG50.973LG60.989WG60.944LG70.979WG70.967LG80.999WG80.924LG90.996WG90.963LG100.935WG100.964

在275 nm檢測波長下，蘆根提取物以S1為對照，相似度在0.935～0.999之間，而葦根提取物除2批相似度較低外，其他8批相似度均高于0.9，提示蘆根與葦根提取物有一定的特征峰穩(wěn)定性，所建立的特征圖譜可各自作為質(zhì)控參考。2種提取物對照圖譜的相似度為0.973，相似度較高是因?yàn)楸Ａ魰r(shí)間在0～49.28 min間，二者特征峰大多類似；但在保留時(shí)間49.28～86.24 min，葦根提取物可檢出6個(gè)黃酮特征峰(w1～w6)。2種藥材提取物特征圖譜有明顯差異，可以達(dá)到鑒別目的。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道，蘆根HPLC指紋圖譜的檢測波長主要有236、250 nm[11-12]。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葦根提取物含有幾個(gè)具有黃酮光譜特征的特征峰，在330～350 nm附近有最大吸收，因此，通過對250、275、310、340 nm 4個(gè)波長下特征峰及峰面積比較發(fā)現(xiàn)，在310 nm處對對香豆酸、阿魏酸等酚酸類成分的吸收較大，但275 nm時(shí)能檢出更多特征峰，對葦根的黃酮類特征峰亦有相對較大吸收，因此選擇275 nm為特征圖譜的檢測波長。比較了乙腈-不同酸水(0.3%乙酸、0.1%H3PO4、0.2%甲酸)、甲醇-不同酸水(0.3%乙酸、0.1%H3PO4、0.2%甲酸)、乙腈-0.5%KH2PO4(pH=2.15)系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果乙腈-0.5%KH2PO4(pH=2.15)系統(tǒng)下蘆根提取物與葦根提取物特征峰能夠得到較好分離，特別是葦根提取物的黃酮特征峰分離度良好。

10批蘆根提取物均能檢出7個(gè)特征峰，樣品相似度在0.935以上，提示不同來源蘆根提取物質(zhì)量較穩(wěn)定。10批葦根提取物亦均檢出與蘆根一致的7個(gè)特征峰(峰1～7)，但比蘆根提取物多6個(gè)黃酮類特征峰(峰w1～w6)，有明顯差別。因此，本研究建立的方法能達(dá)到鑒別蘆根提取物與葦根提取物的目的。