HPLC法測定連翹不同部位中羅漢松樹脂酚苷和牛蒡子苷及其苷元的含量

高納影，賈秀娟，孫華庚，趙艷敏，劉岱琳，高曉霞

(1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510006； 2.山東東阿阿膠股份有限公司，山東聊城 252299； 3.天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，天津 300309； 4.中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院生藥學(xué)與藥劑學(xué)教研室，天津 300162)

連翹為木犀科連翹屬的落葉灌木植物，主產(chǎn)于我國河南、河北、陜西、山西等地，具有清熱解毒、消腫散結(jié)等功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究顯示,連翹具有抗菌、抗病毒、防護(hù)肝損傷等多種作用[2]，化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)其主要活性成分是木脂素、苯乙醇苷、黃酮、三萜等[3]。

近年來，連翹中的質(zhì)量控制成分主要以連翹苷和連翹酯苷A為主，也有蘆丁等黃酮類成分的含量測定研究報道[4]，其他成分的含量報道相對較少。羅彬等[5]首次從連翹中分離得到了羅漢松樹脂酚及其苷類成分。據(jù)報道，羅漢松樹脂酚具有較強(qiáng)的抗氧化[6]、抗病毒[7]等活性。李晉等[8]研究發(fā)現(xiàn)連翹中還含有牛蒡子苷及其苷元。牛蒡子苷及其苷元具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、擴(kuò)張血管等多種活性[9]。本文采用高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地、不同部位的連翹中羅漢松樹脂酚苷、羅漢松樹脂酚、牛蒡子苷及其苷元等4種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，旨在為連翹活性成分的研究及連翹植物的綜合開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

連翹藥材及其植物的不同部位均由天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供。連翹枝條分別采自河北(批號：20170911-1，20170911-2，20170911-3)和河南(批號：20170918-1，20170918-2，20170918-3)。從河北省采摘的連翹的莖、葉和果實的批號分別為20170925-1，20170925-2，20170925-3。所有樣本經(jīng)由武警后勤學(xué)院軍事藥學(xué)教研室張靜澤副教授鑒定為木犀科連翹屬植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl的干燥的莖、枝、葉和果實，樣品標(biāo)本保存在天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司留樣室。

羅漢松樹脂酚苷(Matairesinoside)、羅漢松樹脂酚(Matairesinol)、牛蒡子苷(Arctiin)、牛蒡子苷元(arctigenin)：天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均>98%；乙腈(色譜純)、甲醇(分析純)、95%乙醇(分析純)、正丁醇(分析純)、冰乙酸(分析純)：天津市康科德科技有限公司；娃哈哈純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

DZKW電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；ZDHW調(diào)溫電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；梅特勒XS3DU 超微量電子天平(梅特勒-托利多中國儀器公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；SB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化公司)；高效液相色譜儀(LC-20AT泵，SPD-M20A檢測器，CTO-20A柱溫箱，CBM-20A控制器，SIL-20A進(jìn)樣器，日本島津公司)；Cosmosil色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，Nacalai Tesque)。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取羅漢松樹脂酚苷、羅漢松樹脂酚、牛蒡子苷和牛蒡子苷元對照品適量，置于5 mL量瓶中，用70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇充分溶解并定容至刻度，配成濃度為1.032、1.083、2.102、0.1056 mg/mL的對照品溶液，0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得對照品儲備液。

分別精密量取上述4種對照品儲備液各1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得混合對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取連翹果實、莖、枝、葉各2 g，置于100 mL提取用棕色量瓶中，加入60 mL 70%乙醇回流提取2 h，放至室溫，用70%乙醇溶液定容至100 mL，0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。

1.3.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 流動相：水為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫(0～20 min，20%→100%B；70～70.01 min，100%→20%B；70.01～75 min，20%B)；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL/min；檢測器：DAD檢測器；檢測波長：220 nm，柱溫：30 ℃。取混合對照品溶液和供試品溶液，按上述液相方法進(jìn)行測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。理論塔板數(shù)按牛蒡子苷計算應(yīng)不低于6 000。

1251007550250-255004003002001000mAUmAU羅漢松樹脂酚羅漢松樹脂酚苷牛蒡子苷牛蒡子苷元羅漢松樹脂酚苷牛蒡子苷羅漢松樹脂酚牛蒡子苷元10.015.020.025.030.035.00.05.0t/minBA

A.混合對照品溶液； B.連翹枝供試品(批號20170911-1)溶液。

圖1連翹中4種木脂素的HPLC色譜圖

Figure1HPLC chromatograms of four lignanoids in Forsythiae

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取“1.3.1”項下的1.032 mg/mL的羅漢松樹脂酚苷對照品儲備液各0.1、0.5、2、5、10 mL至25 mL量瓶中，配成質(zhì)量濃度分別為0.004 128、0.020 64、0.082 56、0.206 4、0.412 8 mg/mL的羅漢松樹脂酚苷對照品溶液；精密吸取“1.3.1”項下的1.083 mg/mL的羅漢松樹脂酚對照品儲備液各0.1、0.5、1、1.5、2 mL至10 mL量瓶中，配成質(zhì)量濃度分別為0.010 83、0.054 15、0.108 3、0.162 4、0.216 6 mg/mL的羅漢松樹脂酚對照品溶液；精密吸取“1.3.1”項下的2.102 mg/mL的牛蒡子苷對照品儲備液各0.1、0.5、1、2、5 mL至10 mL量瓶中，配成質(zhì)量濃度分別為0.021 02、0.105 1、0.210 2、0.420 4、1.051 mg/mL的牛蒡子苷對照品溶液；精密吸取“1.3.1”項下的1.032 mg/mL的牛蒡子苷元對照品儲備液各0.1、1、3、6、10 mL至10 mL量瓶中，配成濃度分別為0.001 056、0.010 56、0.031 68、0.063 36、0.105 6 mg/mL的牛蒡子苷元對照品溶液。

取上述各對照品溶液，按“1.3.3”項下進(jìn)行分析，以峰面積(Y)對4種對照品溶液的質(zhì)量濃度(X，mg/mL)進(jìn)行線性回歸方程，結(jié)果4種成分的線性回歸方程及線性范圍分別為：羅漢松樹脂酚苷，Y=16.94×106X-31 604，R2=0.999 1，線性范圍0.004 128～0.412 8 mg/mL；羅漢松樹脂酚，Y=32.09×106X-45 554，R2=0.999 9，線性范圍0.010 83～0.216 6 mg/mL；牛蒡子苷，Y=5.26×106X-13 714，R2=0.999 8，線性范圍0.021 02～1.051 mg/mL；牛蒡子苷元，Y=7.29×106X+110 138，R2=0.999 4，線性范圍0.001 056～0.105 6 mg/mL。

1.3.4.2 精密度試驗 分別量取“1.3.1”項下的混合對照品溶液進(jìn)樣分析，平行測定6次，計算4種成分的峰面積RSD值，結(jié)果顯示羅漢松樹脂酚苷、羅漢松樹脂酚、牛蒡子苷和牛蒡子苷元峰面積的RSD值分別為0.47%、0.31%、0.49%和0.73%，表明在該條件下儀器精密度良好。

1.3.4.3 穩(wěn)定性試驗 取連翹枝(批號20170911-1)按“1.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.3”項下方法分別于0、2、4、6、8、10、12 h測定，計算4種成分的峰面積RSD值，結(jié)果顯示羅漢松樹脂酚苷、羅漢松樹脂酚、牛蒡子苷和牛蒡子苷元峰面積的RSD值分別為1.41%、1.72%、1.53%、0.97%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.4.4 重復(fù)性試驗 取連翹枝(批號20170911-1)6份，分別按“1.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.3”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示羅漢松樹脂酚苷、羅漢松樹脂酚、牛蒡子苷和牛蒡子苷元4種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值分別為1.83%、0.62%、0.31%、0.089%，其RSD值分別為1.96%、1.71%、2.07%、1.80%，表明方法重復(fù)性良好。

1.3.4.5 加樣回收率試驗 分別精密稱取6份已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的連翹枝樣品(批號20170911-1)約1.0 g，按照表1所示精密稱定各對照品適量加入樣品中，按“1.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.3”項下方法進(jìn)行測定，計算加樣回收率，結(jié)果測得回收率為97.7～105.4%，RSD為1.77%～2.65%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

1.3.5 樣品測定 分別取各個批次樣品3份，按“1.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.3”項下的色譜條件下進(jìn)行測定，計算4種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

2.1 兩個產(chǎn)地連翹枝條中4種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較

按“1.3.5”和“1.3.2”項下方法，考察河北省和河南省所產(chǎn)連翹枝條中4種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2?？梢?，河北省和河南省所產(chǎn)的連翹枝條中4種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定差異；整體而言，河北省所產(chǎn)的連翹枝條中4種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高于河南省所產(chǎn)的連翹枝條原料，其中羅漢松樹脂酚苷和牛蒡子苷的差異較大，而羅漢松樹脂酚和牛蒡子苷元的差異不大，河南省的只是略低于河北省所產(chǎn)的原料。因此，以河北省所產(chǎn)原料進(jìn)行后續(xù)試驗。

表1 4種木脂素的加樣回收率試驗Table 1 Results of recovery test of four lignanoids in Forsythiae

表2 不同產(chǎn)地連翹枝條中4種木脂素成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

Table2The contents of four lignanoids in Forsythiae from producing areasw/%

2.2 河北產(chǎn)區(qū)的連翹不同部位中4種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較

按“1.3.1”和“1.3.2”項下方法，考察采自河北地區(qū)連翹的果實、莖、枝和葉的不同組織部位中4種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3。可見，4種成分在連翹不同部位中的分布差異較大，枝條中羅漢松樹脂酚苷、羅漢松樹脂酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為1.85%、0.63%；葉中牛蒡子苷及其苷元的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為3.93%、0.22%；果實中4種木脂素類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都相對較低。因此，可以選擇連翹的枝條和葉作為開發(fā)羅漢松樹脂酚苷、羅漢松樹脂酚、牛蒡子苷和牛蒡子苷元提取物的原料。

表3 連翹不同部位中4種木脂素成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

Table3TThe contents of four lignanoids in different parts of Forsythiae (n=3)w/%

3 討論

《中國藥典》收載連翹為果實入藥，味苦，性微寒，具有散結(jié)消腫、清熱解毒的功效，每年9月份采收的青翹質(zhì)量最佳。每年秋季采收青翹后，連翹的枝條和葉作為廢棄物，研究報道相對較少。木脂素類成分連翹苷和連翹酯苷A是連翹主要的指標(biāo)成分，陳瑾等[10]研究了不同產(chǎn)地連翹果實中連翹苷和連翹酯苷A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在1%和7%以上。王金等[11]探討了不同產(chǎn)地連翹葉中連翹苷和連翹酯苷A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，表明湖南和陜西的連翹葉中連翹苷和連翹酯苷A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在1%和4%以上。目前，對連翹中其他木脂素類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)研究較少。

本文建立了同時測定連翹植物中4種木脂素羅漢松樹脂酚苷、羅漢松樹脂酚、牛蒡子苷和牛蒡子苷元的HPLC法，色譜條件摸索過程中曾分別考察了水和體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、95%的乙醇作為提取溶劑對測定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示：以70%乙醇為提取溶劑時，羅漢松樹脂酚苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)1.85%；以50%乙醇為提取溶劑時，羅漢松樹脂酚和牛蒡子苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為0.71%和0.39%；以95%乙醇為提取溶劑時，牛蒡子苷元質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)0.093%。綜合考慮不同溶劑下4種成分的提取效果，選取70%乙醇作為提取溶劑，可以獲得較好的提取效果，從而保證測試結(jié)果貼近藥材中的真實含量。

本研究結(jié)果顯示，河北省產(chǎn)區(qū)的連翹植物莖葉4種木脂素成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都略高于河南省所產(chǎn)的連翹枝條原料，其中羅漢松樹脂酚苷和牛蒡子苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，而羅漢松樹脂酚和牛蒡子苷元的差異不大，只是略低于河北省所產(chǎn)的原料。在此基礎(chǔ)上，本文還比較了河北省產(chǎn)區(qū)連翹植物不同部位中4種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示成分分布差異很大：枝條中羅漢松樹脂酚苷、羅漢松樹脂酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高；而葉中牛蒡子苷及其苷元的最高，羅漢松樹脂酚的含量極低，已經(jīng)超出了本文測定的線性范圍；果實中4種木脂素類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都相對較低。以上結(jié)果提示，連翹的枝條和葉是可以作為開發(fā)羅漢松樹脂酚苷、羅漢松樹脂酚、牛蒡子苷和牛蒡子苷元提取物的原料的，既可以提高植物廢棄物的利用率，也可促進(jìn)連翹的綜合開發(fā)。