丹參與其偽品、混淆品比較鑒別分析

朱海龍，覃婕媛，陳曉丹，林偉斌，張龍開，姚松君，魏剛

[1.無限極(中國)有限公司，廣東 廣州 510000； 2.弘正道(中國)中藥研究有限公司，廣東 廣州 510000； 3.天方健(中國)藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510000； 4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006]

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，具有活血化瘀、通經(jīng)止疼、清新除煩、涼血消癰的功效[1]。丹參是臨床上作為治療心血管疾病、消化系統(tǒng)疾病、缺血性腦卒中、肝硬化、惡性腫瘤等病癥的重要原料藥[2]，主要道地產(chǎn)區(qū)為安徽、湖北、四川、河南、山西和山東等地[3]。丹參的活性成分主要為兩大類，一類為脂溶性丹參酮類成分，如隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA等；另一類為水溶性酚酸成分，如丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B 等，這些活性成分對(duì)丹參藥理作用及臨床應(yīng)用發(fā)揮著重要的作用[4]。近年來，丹參因其藥用價(jià)值較高，市場(chǎng)需求量較大，其偽品和混淆品也逐漸增多，給丹參藥材的質(zhì)量、臨床用藥的安全性和有效性帶來較大的影響。

目前，市場(chǎng)上丹參的主要偽品為牛蒡根和川續(xù)斷，主要的混淆品或地方習(xí)用品為甘肅丹參、滇丹參和白花丹參，雖然已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道過丹參及其偽品或混淆品的性狀及相關(guān)理化鑒別[5-12]，但大多數(shù)文獻(xiàn)對(duì)于丹參及其偽品或混淆品的性狀、顯微特征及TLC研究比較僅僅限于文字描述，尤其是HPLC圖譜和含量測(cè)定比較研究更未見報(bào)道。因此，本研究通過性狀鑒別、顯微鑒別、薄層以及高效液相色譜法對(duì)丹參及其偽品、混淆品進(jìn)行詳細(xì)的研究，有助于對(duì)丹參的準(zhǔn)確鑒定分析，以保證臨床用藥的療效及安全性。

1 材料與儀器

1.1 儀器

高效液相色譜儀(日本島津公司，DAD檢測(cè)器)；AB204-N精密天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-400KDE高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；OLYMPUS SZ61體視顯微鏡(日本Olympus公司)；HWS24電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；薄層色譜硅膠G預(yù)制板(青島海洋化工有限公司)。

1.2 材料與試劑

丹參對(duì)照藥材(批號(hào)：120923-201615)、丹參酮ⅡA(批號(hào)：110867-201607)、隱丹參酮(批號(hào)：110852-201807)、丹酚酸B(批號(hào)：111562-201716)均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈(色譜級(jí)，德國Merck)；其他試劑為分析純。

丹參、牛蒡根、川續(xù)斷、甘肅丹參、滇丹參及白花丹參樣品均為上海健康醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)家順慶生教授與無限極(中國)有限公司收集，并由順慶生教授鑒定，具體來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參及其偽品、混淆品的性狀鑒別

從圖1可見，丹參根呈長(zhǎng)圓柱形，表面棕紅色或暗棕紅色、粗糙，具縱皺紋，外皮有的呈鱗片狀脫落，斷面皮部棕紅色，木部灰黃色或紫褐色，導(dǎo)管束黃白色，呈放射狀排列；牛蒡根莖稍膨大，殘留的莖基有長(zhǎng)綿毛，根長(zhǎng)圓柱形，較順直，表面棕褐色或黑褐色，皮部黑褐色，木部黃白色，形成層明顯；川續(xù)斷圓柱形，略扁，彎曲，表面棕褐色或灰褐色，有多數(shù)明顯而扭曲的縱紋及溝紋，具橫長(zhǎng)皮孔及須根痕，皮部綠褐色或淡褐色，木部黃褐色，形成層明顯；甘肅丹參體型明顯大于丹參，圓錐形，扭曲麻花狀或辮子狀，多分枝，質(zhì)地較松，斷面極不整齊，具有明顯纖維性；滇丹參則彎曲紡錘形，蘆頭具有數(shù)個(gè)密集的葉痕，成節(jié)，常拐角，斷面不整齊，淺棕黃色，外層有時(shí)暗棕色，邊緣紅紫色；白花丹參為丹參的一個(gè)變型，故外觀與丹參極為相似，不同點(diǎn)在于白花丹參根的斷面皮部灰白色，木部黃白色。綜上所述，可通過性狀差異，初步區(qū)分丹參及其偽品、混淆品。

2.2 丹參及其偽品、混淆品粉末的顯微鑒別

從圖2可見，丹參的石細(xì)胞類圓形、類三角形、類長(zhǎng)方形或不規(guī)則形，且有的含黃棕色物，木纖維多為纖維管胞，長(zhǎng)梭形，導(dǎo)管網(wǎng)紋導(dǎo)管和具緣紋孔導(dǎo)管，木栓細(xì)胞黃棕色，表面類方形或多角形，壁稍厚，不含晶體；牛蒡根的木纖維多細(xì)長(zhǎng)，溝孔不明顯，含有菊糖呈扇形，有放射紋理；川續(xù)斷可見有斜向交錯(cuò)的紋理紡錘形薄壁細(xì)胞，草酸鈣簇晶眾多，多見成行排列；滇丹參、甘肅丹參及白花丹參的木纖維、導(dǎo)管和木栓細(xì)胞顯微特征與丹參差別較小，滇丹參和甘肅丹參中可觀察到孔溝明顯、含黃棕色物的石細(xì)胞，但是白花丹參中未見石細(xì)胞。綜上所述，丹參與牛蒡根、川續(xù)斷、白花丹參可通過顯微粉末鑒別區(qū)分，較難鑒別甘肅丹參和滇丹參。

2.3 丹參及其偽品、混淆品的薄層色譜鑒別

參照2015年版《中國藥典》丹參項(xiàng)下條件，照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)[1]，在日光和紫外燈(365 nm)下檢視可知，丹參對(duì)照藥材與牛蒡根、川續(xù)斷供試品的薄層斑點(diǎn)位置和顏色明顯不一致，牛蒡根和川續(xù)斷不含丹參酮ⅡA紫色斑點(diǎn)，但是紫外燈下清晰可見牛蒡根、川續(xù)斷有與對(duì)照品丹酚酸B斑點(diǎn)位置相近的斑點(diǎn)；甘肅丹參與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜對(duì)比可知，含有丹參酮ⅡA斑點(diǎn)，但不含丹酚酸B斑點(diǎn)，并在其丹參酮ⅡA斑點(diǎn)下有較亮的熒光斑點(diǎn)可以明顯與丹參區(qū)別；滇丹參與對(duì)照品、對(duì)照藥材對(duì)比可知，其丹酚酸B、丹參酮ⅡA斑點(diǎn)以及其他斑點(diǎn)均較黯淡，但丹參酮ⅡA斑點(diǎn)下有較暗的熒光斑點(diǎn)；白花丹參供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材及丹參色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)和熒光斑點(diǎn)。綜合以上結(jié)果，根據(jù)2015年版《中國藥典》薄層色譜條件，可以明顯區(qū)別丹參的偽品牛蒡根和川續(xù)斷，以及其混淆品甘肅丹參和滇丹參，但是難以區(qū)別白花丹參，結(jié)果見圖3。

表1 丹參及其偽品、混淆品樣品來源Table 1 The sources of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma and its counterfeit,adulterants

A.丹參(1.縱皺紋; 2.外表紅色或暗棕紅色; 3.外皮有的呈鱗片狀脫落)； B.牛蒡根(1.縱溝紋; 2.莖基處長(zhǎng)棉毛; 3.外表皮棕褐色或黑褐色)； C.川續(xù)斷(1.扭曲縱溝紋紋; 2.稍扁; 3.質(zhì)稍軟； 4.外表皮棕褐色或灰褐色)； D.甘肅丹參(1.分枝多扭曲; 2.體形較大，質(zhì)松而脆)； E.滇丹參(1.葉痕密集成節(jié); 2.紡錘形； 3.數(shù)個(gè)簇生)； F.白花丹參(1.須根眾多; 2.外表皮棕紅色或暗棕紅色)。

圖1丹參及其偽品、混淆品的性狀

Figure1The trait characteristics of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma and its counterfeit,adulterants

A.丹參(1a、1b.石細(xì)胞; 2.木栓細(xì)胞; 3a、3b.木纖維; 4a、4b.導(dǎo)管)； B.牛蒡根(1a、1b.菊糖; 2.木栓細(xì)胞; 3a、3b.木纖維; 4a、4b.導(dǎo)管)； C.川續(xù)斷(1a、1b.簇晶; 2.木栓細(xì)胞; 3a、3b.薄壁細(xì)胞; 4a、4b.導(dǎo)管)； D.白花丹參(1.木栓細(xì)胞; 2a、2b.木纖維; 3a、3b.導(dǎo)管)； E.滇丹參(1a、1b.石細(xì)胞; 2.木栓細(xì)胞; 3a、3b.木纖維; 4a、4b.導(dǎo)管)； F.甘肅丹參(1a、1b.石細(xì)胞; 2.木栓細(xì)胞; 3a、3b.木纖維; 4a、4b.導(dǎo)管)。

圖2丹參及其偽品、混淆品的顯微特征

Figure2The microscopic characteristics of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma and its counterfeit,adulterants

2.4 丹參及其混淆品的HPLC特征圖譜鑒別

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Zorbax SB-Aq(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈(A)-質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%H3PO4溶液(B)作為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～20 min，15%～25%A；20～35 min，25%～60%A；35～45 min，60%～70%A；45～70 min，70%～80%A)；流速:1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

1.牛蒡根； 2.川續(xù)斷； 3.甘肅丹參； 4. 滇丹參； 5.白花丹參； 6.丹酚酸B和丹參酮ⅡA； 7.丹參對(duì)照藥材； 8.丹參。

圖3丹參藥材及其偽品、混淆品薄層色譜圖

Figure3TLC of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma and its counterfeit,adulterants

2.4.2 供試品溶液的制備 丹參及其混淆品(甘肅丹參、滇丹參及白花丹參)樣品切斷約1 cm，60 ℃烘箱烘干，粉碎，過4號(hào)篩，取樣品粉末1 g，精密稱定，置于25 mL錐形瓶中，加入乙醇10 mL，超聲提取15 min，放至室溫，離心，取上清液，0.22 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.4.3 對(duì)照品溶液的制備 取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇-水(體積比8∶2)混合溶液，制成每1 mL含0.10 mg的溶液，即得；取丹參酮ⅡA和隱丹參酮對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，0.22 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察色譜圖的相似度，相似度均大于 0.99，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積RSD值均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液5 μL，分別在0、2、6、12、18、24 h進(jìn)樣分析，相似度均大于 0.99，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積RSD值均小于3.0%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定；

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批丹參樣品，制成6份供試品溶液并進(jìn)樣分析，相似度均大于 0.99，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積RSD值均小于3.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.7 丹參及其混淆品特征圖譜分析 分別取表1中11批丹參樣品，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，采用國家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2012版)，以均值數(shù)法分析，生成丹參對(duì)照?qǐng)D譜，共標(biāo)示出9個(gè)特征峰，通過對(duì)照品保留時(shí)間定位，鑒定峰3、7、9分別為丹酚酸B、隱丹參酮及丹參酮ⅡA。將丹參對(duì)照HPLC圖譜及其混淆品HPLC圖譜對(duì)比可知，滇丹參的峰面積均較低，其丹參酮類成分比例與丹參有一定的區(qū)別，沒有丹參1、2號(hào)特征峰，且丹酚酸B的相對(duì)含量偏低；而甘肅丹參幾乎不含有丹酚酸B，沒有丹參2號(hào)特征峰；白花丹參與丹參二者特征圖譜相似度較高，此色譜條件未能有效區(qū)分白花丹參與丹參，特征圖譜分析結(jié)果與薄層色譜鑒別結(jié)果相一致，結(jié)果見圖4。

2.5 丹參及其混淆品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

參照2015年版《中國藥典》丹參項(xiàng)下條件，按高效液相色譜法(通則0512)測(cè)定所收集的丹參及其混淆品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[1]，《中國藥典》要求含丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ的總量不得少于0.25%，含丹酚酸B不得少于3.0%。本研究的測(cè)定結(jié)果表明，收集所得丹參和白花丹參所含丹酚酸B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均符合《中國藥典》要求，滇丹參中丹酚酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于《中國藥典》要求，而甘肅丹參中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)極少；丹參、白花丹參、甘肅丹參所含的丹參酮類總量符合《中國藥典》要求，滇丹參和所購的丹參飲片丹參酮類總量低于《中國藥典》要求；質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果與薄層色譜鑒定結(jié)果、HPLC特征圖譜結(jié)果相一致，表明丹參與滇丹參中丹酚酸B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和丹參酮類總量有明顯區(qū)別，而與甘肅丹參中丹酚酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)有明顯區(qū)別，但是無法區(qū)別白花丹參，結(jié)果見表2。

白花丹參甘肅丹參滇丹參丹參2000150010005000U/mV010203040506070t/minS1S2S3S4

3.丹酚酸B；7.隱丹參酮；9.丹參酮ⅡA。

圖4丹參及其混淆品HPLC特征圖譜

Figure4HPLC characteristic spectrums of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma and its adulterants

表2 丹參及其混淆品中丹酚酸B與丹參酮類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果Table 2 The content of tanshinones in the Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma and its adulterants

3 討論

丹參是中醫(yī)藥領(lǐng)域中臨床應(yīng)用較為廣泛、療效確切的中藥材，植物資源豐富，全國大部分地區(qū)均有栽培，但隨著丹參的廣泛應(yīng)用，其偽品及混淆品也逐漸增多，本研究對(duì)丹參及其偽品(牛蒡根、川續(xù)斷)、混淆品(甘肅丹參、滇丹參及白花丹參)進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒別研究，填補(bǔ)了目前所缺失的性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜(TLC)鑒別比較的報(bào)道，以及高效液相色譜(HPLC)鑒定和含量測(cè)定的比較研究。

綜合本研究結(jié)果可見：(1)從性狀鑒別來看，丹參及其偽品、混淆品外觀性狀特征具有一定差別，從外觀形狀和顏色能較好區(qū)分牛蒡根、川續(xù)斷、甘肅丹參、滇丹參，對(duì)于外觀較為相似的白花丹參，可從白花丹參斷面皮部灰白色與丹參皮部棕紅色進(jìn)行初步區(qū)別，但是近幾年也逐漸出現(xiàn)了皮部呈灰白色的丹參，與藥典描述并不相符，應(yīng)該注意這種變化，可進(jìn)一步根據(jù)顯微觀察粉末中是否含有石細(xì)胞進(jìn)行鑒別。(2)從顯微鑒別來看，丹參能與其偽品牛蒡根、川續(xù)斷區(qū)分，三者顯微特征差別較為明顯，偽品牛蒡?qū)倬湛?，川續(xù)斷屬于川續(xù)斷科，牛蒡根含有菊糖，川續(xù)斷草酸鈣簇晶眾多，并成行排列，丹參不含有菊糖和晶體，可作為三者主要鑒別特征；而丹參混淆品白花丹參、甘肅丹參和滇丹參均為丹參同科植物，顯微特征差異小，較難區(qū)分，其中丹參和甘肅丹參、滇丹參均可觀察到石細(xì)胞，但是白花丹參卻未觀察到石細(xì)胞，目前相關(guān)文獻(xiàn)也未見報(bào)道過白花丹參粉末觀察到石細(xì)胞[13-14]，可作為其鑒別特征之一。(3)從TLC鑒別來看，采用2015年版《中國藥典》中丹參項(xiàng)下TLC方法，根據(jù)兩個(gè)偽品的薄層色譜斑點(diǎn)位置、顏色與對(duì)照藥材色譜對(duì)比，可以明顯區(qū)別牛蒡根和川續(xù)斷，甘肅丹參薄層色譜中不顯示丹酚酸B斑點(diǎn)，并在紫外燈(365 nm)下可根據(jù)甘肅丹參與滇丹參丹參酮ⅡA斑點(diǎn)下的熒光斑點(diǎn)可與丹參對(duì)照藥材區(qū)分，但是無法區(qū)別白花丹參。(4)從HPLC特征圖譜鑒別來看，根據(jù)丹酚酸B、丹參1號(hào)、2號(hào)特征峰、及丹參酮類成分比例可以區(qū)分丹參與甘肅丹參、滇丹參，但是難以區(qū)別白花丹參；(5)從含量測(cè)定來看，甘肅丹參中丹酚酸B含量極少，而滇丹參中丹酚酸B和丹參酮類總量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正品丹參及者《中國藥典》規(guī)定的要求，這也是丹參與其混淆品不能混用的重要原因之一，白花丹參中丹參酮類總量及丹酚酸B的含量符合《中國藥典》要求。綜上所述，本研究所提出的性狀、顯微、TLC法、HPLC法鑒別可以簡(jiǎn)便、快速、高效、準(zhǔn)確地鑒別丹參及其偽品、混淆品藥材，為丹參藥材的質(zhì)量保障提供參考依據(jù)。