VEGF/VEGFR 2信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

陳東，馮林森，王羽豐#昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院暨云南省腫瘤醫(yī)院干部醫(yī)療科，昆明6508

2昆明醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院暨云南省玉溪市人民醫(yī)院血液科，云南 玉溪6534050

自1971年Folkman[1]首先提出“實(shí)體惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移離不開新生血管”這一觀點(diǎn)后，人們逐漸認(rèn)識(shí)到腫瘤的發(fā)展過程與血管新生密切相關(guān)，因此，抗腫瘤血管生成的研究不斷深入。腫瘤血管新生的過程受腫瘤微環(huán)境中諸多因素的影響，目前已知的共同調(diào)節(jié)血管生成的信號(hào)通路有數(shù)十種，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）構(gòu)成的信號(hào)通路是作用最強(qiáng)的正性調(diào)控通路之一，對血管新生的整個(gè)過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，發(fā)揮了不可替代的作用。然而有關(guān)VEGF/VEGFR2信號(hào)通路上游的分子調(diào)控機(jī)制尚不明確，本文通過總結(jié)調(diào)控該信號(hào)通路的潛在靶點(diǎn)，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 EMP 2與VEGF/VEGFR 2信號(hào)通路

上皮細(xì)胞膜蛋白2（epithelial membrane protein 2，EMP2）是屬于生長抑制特異性基因3（growth arrest-specific gene 3，GAS3）/外周髓鞘蛋白 22（peripheral myelin protein 22，PMP22）家族的四聚體蛋白[2]，廣泛分布于Ⅰ型肺泡細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、皮膚角質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及角膜上皮細(xì)胞中[3-6]。在子宮內(nèi)膜癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，EMP2可正性調(diào)節(jié)VEGF并加速血管生成。Gordon等[7]在子宮內(nèi)膜癌移植瘤模型中發(fā)現(xiàn)，EMP2與VEGF的分泌水平呈正相關(guān)。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）結(jié)果表明，EMP2過表達(dá)組的VEGF mRNA表達(dá)水平升高，EMP2低表達(dá)組的VEGF mRNA表達(dá)水平下降。該研究認(rèn)為，在缺氧的條件下，EMP2可促進(jìn)局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）和原癌基因SRC活化，從而上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1A（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF1A）的表達(dá)，通過HIF1A依賴途徑誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，并最終誘導(dǎo)毛細(xì)血管新生。然而EMP2對HIF1A表達(dá)的調(diào)控機(jī)制仍不明確，需進(jìn)一步研究。Morales等[8]在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，蛋白質(zhì)印跡（Western blot）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）結(jié)果表明，EMP2過表達(dá)組的VEGF水平較對照組高150%，而EMP2低表達(dá)組的VEGF水平較對照組低57%；采用過表達(dá)EMP2的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞上清液培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞后，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和成管能力明顯升高。該研究認(rèn)為，EMP2對VEGF的上調(diào)作用有望成為視網(wǎng)膜疾病抗血管治療的全新靶點(diǎn)。Qin等[9]研究發(fā)現(xiàn)，EMP2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中具有較高的特異性。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，EMP2可促進(jìn)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的血管生成，通過增加血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）的分泌與表達(dá)，加速內(nèi)皮細(xì)胞遷移和毛細(xì)血管形成；在腫瘤細(xì)胞中加入抗EMP2免疫球蛋白G1（immunoglobulin G1，IgG1）抗體后，VEGFA水平明顯下降[10]。該研究還認(rèn)為，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，血腦屏障的完整性被破壞，抗EMP2 IgG1抗體成功通過率提高，有望成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的新型靶向藥物。此外，Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，EMP2對多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲具有促進(jìn)作用，體內(nèi)試驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用EMP2抗體后，腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少，腫瘤負(fù)荷明顯下降。

雖然上述研究中應(yīng)用EMP2抗體對VEGF的抑制效果可觀，但其作用機(jī)制可能不僅僅局限于抗血管生成，且遠(yuǎn)期療效仍需大量研究證實(shí)。此外，不同的惡性腫瘤中，EMP2扮演著截然不同的角色。在B細(xì)胞淋巴瘤、鼻咽癌、泌尿上皮癌中，EMP2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤進(jìn)展及侵襲[11-13]；而在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，EMP2的表達(dá)明顯上調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展和侵襲呈正相關(guān)，研究認(rèn)為EMP2可成為上述4種腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物，并有望成為潛在的治療靶點(diǎn)[14-16]。

2 miRNA-29 a與VEGF/VEGFR 2信號(hào)通路

微小RNA-29a（microRNA-29a，miRNA-29a）屬于miRNA-29家族成員（miRNA-29a/b/c）之一，大量研究已證實(shí)miRNA-29a與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡[17]、侵襲[18]、預(yù)后[19]、耐藥[20]等有關(guān)。在胃癌中，miRNA-29可通過抑制VEGFA的表達(dá)減少腫瘤血管新生。李學(xué)成等[21]應(yīng)用定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）和ELISA技術(shù)分別檢測50例胃癌患者的血清miRNA-29a及VEGFA水平，發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；根據(jù)miRNA-29a的表達(dá)水平，將113例胃癌組織分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，高表達(dá)組中VEGFA的表達(dá)量明顯高于低表達(dá)組。王國威等[22]采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確，miRNA-29a可直接與VEGFA mRNA的3'UTR相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)VEGFA mRNA的降解，從而下調(diào)VEGFA的表達(dá)水平。體內(nèi)研究證實(shí)，miRNA-29a可明顯抑制裸鼠移植瘤生長，并降低移植瘤內(nèi)微血管密度（microvascular density，MVD），該結(jié)果可能與miRNA-29a抑制VEGFA的表達(dá)有關(guān)[23]。Zhang 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-29a/c過表達(dá)可降低胃癌細(xì)胞中VEGFA的表達(dá)水平，將胃癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，內(nèi)皮細(xì)胞的生長、增殖和管腔形成明顯受到抑制；細(xì)胞微泡能夠有效地將miRNA-29a/c運(yùn)輸至胃癌細(xì)胞內(nèi)，某種程度上發(fā)揮了載體和保護(hù)的功能。

有關(guān)miRNA的研究為靶向或基因治療提供了新的臨床思路，雖然miRNA-29a能有效抑制VEGF的分泌與表達(dá)，但其抗血管生成效果及安全性還需進(jìn)一步研究。

3 miRNA-377與VEGF/VEGFR 2信號(hào)通路

諸多研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-377（microRNA-377，miRNA-377）可抑制食管癌和胃癌的發(fā)展，并通過抑制VEGF的表達(dá)調(diào)控血管生成。Li等[25]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-377在食管鱗癌組織標(biāo)本及患者血清中的表達(dá)水平均明顯下降，其表達(dá)水平與患者的生存期呈正相關(guān)，與病理分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均呈負(fù)相關(guān)；miRNA-377過表達(dá)可抑制食管鱗癌的生長、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及血管生成，而miRNA-377低表達(dá)后結(jié)果相反；熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-377可直接結(jié)合VEGF的3'UTR。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞及組織標(biāo)本中miRNA-377的表達(dá)量均低于正常細(xì)胞及組織；體外實(shí)驗(yàn)中，miRNA-377過表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的生長及遷移；構(gòu)建pcDNA 3.1-VEGFA載體后，miRNA-377對VEGFA的抑制效果可發(fā)生逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步證實(shí)了miRNA-377可通過下調(diào)VEGFA的表達(dá)抑制胃癌的進(jìn)展。Wen等[27]在體外實(shí)驗(yàn)中將miRNA-377抑制劑轉(zhuǎn)染至人臍靜脈內(nèi)皮細(xì) 胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-377抑制劑可促進(jìn)管腔形成；在心肌缺血大鼠模型中，敲除內(nèi)源性miRNA-377可直接上調(diào)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而刺激間質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成，減少心肌纖維化并改善心肌功能。

4 miRNA-101與VEGF/VEGFR 2信號(hào)通路

微小 RNA-101（microRNA-101，miRNA-101）在腫瘤中的作用機(jī)制成為另一個(gè)研究熱點(diǎn)，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其與血管生成關(guān)系密切，并主要負(fù)性調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGFC）的表達(dá)，對 VEGFR2的磷酸化也有增強(qiáng)作用。Deng等[28]在肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞和組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，miRNA-101可直接下調(diào)VEGFC的表達(dá)水平，從而抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的侵襲和遷移。Liu等[29]在肝癌組織和細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。Li等[30]在鉑耐藥胃癌細(xì)胞中證實(shí)，miRNA-101的表達(dá)水平明顯下降，并且與VEGFC水平呈負(fù)相關(guān)，將miRNA-101類似物轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞后，胃癌細(xì)胞的增殖率下降，凋亡率升高。Lei等[31]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，miRNA-101可直接下調(diào)VEGFC的表達(dá)，并抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miRNA-101可以提高膀胱癌細(xì)胞對順鉑化療的敏感性。以上3項(xiàng)研究均采用熒光素酶法證實(shí)VEGFC是miRNA-101的直接靶點(diǎn)，但有關(guān)miRNA-101與血管生成關(guān)系的研究仍需進(jìn)一步完善。Kim等[32]在體外研究中發(fā)現(xiàn)miRNA-101對缺氧條件敏感，將外源性miRNA-101轉(zhuǎn)染至HUVEC后，可上調(diào)血紅素氧化酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)HIF1A介導(dǎo)的VEGF表達(dá)；此外，過表達(dá)的miRNA-101還可加強(qiáng)VEGFR2的磷酸化作用，并促進(jìn)其下游效應(yīng)蛋白的表達(dá)，如FAK、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK），最終促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成；在下肢缺血小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，miRNA-101可明顯改善缺血下肢血流情況，增加毛細(xì)血管數(shù)量。Liu等[33]在胃癌細(xì)胞和組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)miRNA-101、miRNA-27b、miRNA-128可抑制VEGFC的表達(dá)，并與MVD呈負(fù)相關(guān)；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三者的表達(dá)可減少VEGFC的分泌，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及管腔形成；但3種miRNA之間并未發(fā)現(xiàn)協(xié)同作用，仍需進(jìn)一步研究。

5 PDCL 3與VEGF/VEGFR 2信號(hào)通路

光導(dǎo)蛋白樣蛋白（phosducin-like protein，PhLP）是一種保守型蛋白家族，具有與硫氧還原蛋白相似的結(jié)構(gòu)域，最初被認(rèn)為是G蛋白信號(hào)通路的調(diào)節(jié)器。該蛋白家族成員包括PhLP1、PhLP2A（又稱為PDCL3）、PhLP2B和PhLP3[34]。PDCL3可調(diào)節(jié)VEGFR2的穩(wěn)態(tài)，并在缺氧情況下促進(jìn)血管生成。

體外研究發(fā)現(xiàn)，作為一種新型蛋白，PDCL3與VEGFR2的穩(wěn)定性有關(guān)，并扮演該受體分子伴侶的角色[35]。無需VEGF配體介導(dǎo)的磷酸化，PDCL3便能與VEGFR2的近膜域結(jié)合，通過抑制VEGFR2的泛素化和降解，從而調(diào)控其表達(dá)量。PDCL3還可以促進(jìn)VEGF誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化。此外，VEGFR2介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和毛細(xì)血管形成同樣需要PDCL3的參與。PDCL3調(diào)控了VEGFR2的表達(dá)量與功能，并在后續(xù)的血管生成中發(fā)揮了重要作用。Srinivasan等[36]研究發(fā)現(xiàn)，PDCL3位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及細(xì)胞質(zhì)間隔，主要與細(xì)胞內(nèi)的VEGFR2結(jié)合，可協(xié)助VEGFR2折疊，再次證實(shí)其分子伴侶的作用。體外實(shí)驗(yàn)中，通過干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默HUVEC的PDCL3表達(dá)后，VEGFR2酪氨酸激酶磷酸化對VEGF配體的敏感性明顯下降。在斑馬魚和小鼠實(shí)驗(yàn)中，PDCL3同樣展現(xiàn)了其促血管生成的生物學(xué)意義。另外，缺氧條件能夠上調(diào)PDCL3的表達(dá)，進(jìn)一步加深了人們對缺氧條件促血管生成機(jī)制的了解。然而，PDCL3還可能受其他血管生成因子的調(diào)控。有研究在人卵巢上皮癌裸鼠移植瘤模型中發(fā)現(xiàn)，貝伐珠單抗組和阿帕替尼組的PDCL3表達(dá)量均高于對照組，認(rèn)為PDCL3可能與抗血管藥物的耐藥有關(guān)[37]。

由于目前腫瘤抗血管治療產(chǎn)生的耐藥限制了其療效，干擾PDCL3的表達(dá)在理論上可能會(huì)增加腫瘤患者對抗血管藥物的獲益，但PDCL3在各類腫瘤中是否異常表達(dá)需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

6 AIBP與VEGF/VEGFR 2信號(hào)通路

載脂蛋白A-I結(jié)合蛋白（apoA-I binding protein，AIBP）是應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)從人肝臟cDNA文庫中篩選的一種分泌蛋白，主要由高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）組成，可與載脂蛋白A-I結(jié)合[38-39]。Fang等[40]研究發(fā)現(xiàn)，AIBP介導(dǎo)的膽固醇流出可對新生血管進(jìn)行負(fù)性調(diào)控。在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，AIBP可與HDL協(xié)同促進(jìn)膽固醇流出，抑制了VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成。該研究還發(fā)現(xiàn)，膽固醇流出也影響了細(xì)胞膜上的脂筏結(jié)構(gòu)，脂筏的破壞阻礙了細(xì)胞膜表面VEGFR2的二聚化，使VEGF/VEGFR2信號(hào)的傳導(dǎo)受到抑制。此外，該信號(hào)通路中多種蛋白激酶（如VEGFR2、FAK、ERK1/2、AKT）的磷酸化也部分減弱。將人類 AIBP（human apoA-I binding protein，hAIBP）及斑馬魚 AIBP2（zebrafish apoA-I binding protein 2，zAIBP2）基因轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，隨后移植入小鼠主動(dòng)脈環(huán)，與對照組相比，hAIBP組和zAIBP2組主動(dòng)脈環(huán)處的血管生成明顯受到抑制。體外實(shí)驗(yàn)中，研究者運(yùn)用嗎啉代寡核苷酸抑制了斑馬魚胚胎中zAIBP2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)前段動(dòng)脈的脂筏數(shù)量和新生血管明顯增加；而補(bǔ)充了足量的HDL后，zAIBP2的缺失效應(yīng)得以彌補(bǔ)，膽固醇流出再次加強(qiáng)，前段動(dòng)脈脂筏數(shù)量減少，血管新生受到抑制。Western blot結(jié)果證實(shí)，zAIBP2的低表達(dá)提高了VEGFR2信號(hào)通路的磷酸化水平，并且促進(jìn)了血管生成素-1受體TIE2、VEGFR3、Friend白血病病毒整合素-1（Friend leukemia integration-1，F(xiàn)LI-1）及其他血管生成因子的表達(dá)。

在體內(nèi)外研究中，AIBP能夠促進(jìn)膽固醇流出從而調(diào)節(jié)脂筏數(shù)量以及VEGFR2信號(hào)通路，最終調(diào)控血管生成。值得注意的是，膽固醇代謝紊亂與惡性腫瘤密切相關(guān)[41]，AIBP介導(dǎo)的膽固醇流出能否對腫瘤血管生成進(jìn)行調(diào)控，值得進(jìn)一步深究。

7 小結(jié)和展望

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與血管新生密切相關(guān)，抑制血管新生是一種有效的治療手段。在過去的幾十年中，對VEGF/VEGFR2信號(hào)通路的體內(nèi)外研究取得了大量的成果，已有大量抗血管生成藥物，如VEGF單克隆抗體貝伐珠單抗和阿柏西普，VEGFR2酪氨酸激酶抑制劑阿帕替尼、索拉非尼、蘇尼替尼等已應(yīng)用于臨床，大量Ⅲ期臨床試驗(yàn)證實(shí)抗血管治療提高了晚期非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)直腸癌患者的無進(jìn)展生存時(shí)間和（或）總生存時(shí)間，但仍有一些問題亟須解決：①需發(fā)現(xiàn)特異性生物標(biāo)志物明確抗血管治療獲益人群[42]；②單一抗血管治療并不理想，需與化療及其他治療方案聯(lián)合[43]；③抗血管治療數(shù)月后發(fā)生耐藥，機(jī)制尚不明確[44]；④部分患者對不良反應(yīng)無法耐受，最佳藥物劑量與時(shí)間還需優(yōu)化[45]；⑤抗血管治療并非適用于所有實(shí)體瘤，也有可能促進(jìn)病情進(jìn)展[46]。VEGF/VEGFR2信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制是未來的研究方向，臨床研究者仍需對腫瘤血管生成機(jī)制進(jìn)行深入研究，為腫瘤治療提供新的方向和策略。