FLT-PET監(jiān)測(cè)靶向治療ALK陽(yáng)性淋巴瘤早期療效優(yōu)于FDG-PET

侵襲性非霍奇金淋巴瘤的標(biāo)準(zhǔn)療法是環(huán)磷酰胺-阿霉素-長(zhǎng)春新堿-強(qiáng)的松或康速龍錠等類似藥物，在B細(xì)胞起源的情況下再結(jié)合利妥昔單克隆抗體［1］，然而并非對(duì)所有患者有效，復(fù)發(fā)性NHL預(yù)后不良。以受體信號(hào)分子（例如BTK、Syk、PKCb）、抗凋亡蛋白、脫乙酰酶和免疫調(diào)節(jié)劑為靶標(biāo)的靶向性小分子藥物的研究日益白熱化［2,3］。盡管靶向性藥物可能對(duì)復(fù)發(fā)的淋巴瘤治療大有助益，但是其種類繁多。選擇合適的生物標(biāo)靶，對(duì)其治療效果進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)意義重大。準(zhǔn)確評(píng)估早期療效，有助于優(yōu)化治療方案，避免無(wú)效治療和降低治療成本。

FDG-PET成像被證實(shí)可用于淋巴瘤治療后的預(yù)后分析［4,5］和治療中的療效監(jiān)測(cè)［6,7］。這些研究表明，在治療進(jìn)行中PET具有預(yù)測(cè)無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期的能力。也有研究指出FDG-PET特異性不足、預(yù)測(cè)價(jià)值有限［8-10］。究其原因，可能是FDG并非腫瘤特異性示蹤劑，炎癥也可引起FDG聚 集［11］。

細(xì)胞周期的混亂失調(diào)是癌細(xì)胞的顯著特點(diǎn)，持續(xù)不斷的增殖活性比葡萄糖代謝的增加在檢測(cè)惡性腫瘤時(shí)更具特異性［12］。FLT是一種穩(wěn)定的PET示蹤劑，可在增殖組織和惡性腫瘤中聚集［13,14］。一些研究顯示FLT攝取與腫瘤的增殖具有顯著的相關(guān)性［15-18］。筆者之前的工作也表明侵襲性淋巴瘤首次治療后FLT攝取的降低情況與治療終止時(shí)的療效直接相關(guān)［19］。

研究證明50%～60%的間變性大細(xì)胞淋巴瘤（ALCL）存在染色體異位并與間變性淋巴瘤激酶（ALK）基因相關(guān)，且引起致癌蛋白核仁磷酸蛋白間變性淋巴瘤激酶（nucleophosmin-ALK：NPM-ALK）的過(guò)表 達(dá)［20,21］。一些研究表明，酪氨酸激酶的活性是NPM-ALK陽(yáng)性ALCL發(fā)病的關(guān)鍵因素，且導(dǎo)致STAT3、PI-3K/Akt和mTOR等信號(hào)通路的激活［22,23］。因此，ALK及ALK信號(hào)通路便成為治療ALCL的靶標(biāo)。除了ALK抑制劑外，正在進(jìn)行的臨床前測(cè)試和臨床研究表明熱休克蛋白90（HSP90）和mTOR的抑制可導(dǎo)致ALK陽(yáng)性ALCL細(xì)胞中ALK降解［24,25］。

本課題中使用HSP90抑制劑NVP-AUY922（AUY922）和mTOR抑制劑癌伏妥對(duì)ALK陽(yáng)性淋巴瘤小鼠進(jìn)行治療；并對(duì)其行FDG和FLT-PET來(lái)監(jiān)測(cè)ALK陽(yáng)性淋巴瘤對(duì)治療的早期反應(yīng)。

圖1 FLT攝取對(duì)NPM-ALK陽(yáng)性ALCL細(xì)胞的HSP90抑制治療反應(yīng)敏感。SUDHL-1細(xì)胞經(jīng)不同濃度的AUY922處理48 h。a）使用MTT從測(cè)量細(xì)胞生存率；b）左邊是細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果，右邊是細(xì)胞死亡率結(jié)果；c）使用免疫組化監(jiān)測(cè)致癌蛋白表達(dá)及磷酸化活性；d）癌細(xì)胞FDG和FLT的攝取隨AUY922濃度升高而降低

FLT的攝取可顯示NPM-ALK陽(yáng)性ALCL細(xì)胞對(duì)HSP90抑制劑NVP-AUY922治療的反應(yīng)

MTT分析顯示SUDHL-1對(duì)NVP-AUY922治療敏感，治療48 h后，最高療效濃度為100 nM，50%的抑制濃度（IC50）應(yīng)小于10 nM（圖1a）。AUY922治療可引起細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞死亡，主要表現(xiàn)為S期細(xì)胞量的減少、G0-G1期細(xì)胞的大量聚集以及AnnexinV陽(yáng)性細(xì)胞的增加（圖1b）。另外，在AUY922干預(yù)下磷酸化及總NPM-ALK蛋白表達(dá)也隨著AUY922濃度的增加而降低（圖1c），而且當(dāng)AUY922濃度為50 nM時(shí)，其下游蛋白STAT3和AKT［22］的表達(dá)已無(wú)法檢測(cè)到。使用伽馬計(jì)數(shù)器可測(cè)得在AUY922干預(yù)下，F(xiàn)LT和FDG在SUDHL-1細(xì)胞中的攝取也有明顯下降，且FLT比FDG更敏感（圖1d）。這些數(shù)據(jù)表明FLT可能比FDG更適合于監(jiān)測(cè)以NPM-ALK為靶標(biāo)的治療。

在監(jiān)測(cè)HSP90抑制劑靶向治療SUDHL-1淋巴瘤時(shí)，F(xiàn)LT-PET的預(yù)測(cè)效果優(yōu)于FDG-PET

使用SUDHL-1淋巴瘤小鼠模型來(lái)研究HSP90抑制，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到500 mm3時(shí)開(kāi)始對(duì)小鼠進(jìn)行治療，治療時(shí)間2周。對(duì)照組小鼠的腫瘤體積在整個(gè)過(guò)程中增加了3倍（圖2a）。相反的，AUY922治療組小鼠的腫瘤體積幾乎沒(méi)有變化。為了評(píng)估FDG和FLT-PET在預(yù)測(cè)治療效果中的價(jià)值，筆者對(duì)所有小鼠在治療前以及治療開(kāi)始后5 d行PET顯像。在FDG-PET檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠腫瘤的FDG攝取有了顯著增加（P=0.03）（圖2b），但治療組的FDG攝取沒(méi)有明顯變化（P=0.151）。相比之下，F(xiàn)LT的攝取卻降至治療前的40%，變化顯著（P=0.001）（圖2c）。對(duì)照組的FLT攝取增至治療前的200%（P=0.01）。另外，也對(duì)SUDHL-1淋巴瘤的病理檢測(cè)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示治療組腫瘤caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞明顯高于對(duì)照組（P=0.04）（圖2d）；而Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞在治療組腫瘤中為15.3%，明顯低于對(duì)照組的63.3%（P=0.03）。總之，F(xiàn)DG及FLT攝取與腫瘤對(duì)HSP90抑制的反應(yīng)直接相關(guān)。在腫瘤體積出現(xiàn)明顯變化之前，F(xiàn)LT-PET對(duì)療效的評(píng)估及預(yù)測(cè)效果優(yōu)于FDG-PET。

圖2 功能成像FLT-PET在監(jiān)測(cè)HSP90抑制治療SUDHL-1淋巴瘤療效時(shí)比FDG-PET更好。當(dāng)攜帶SUDHL-1淋巴瘤的小鼠身上的腫瘤體積達(dá)到500 mm3時(shí)，開(kāi)始AUY922的治療（25 mg/kg，腹腔注射），測(cè)量腫瘤體積和FLT以及FDG攝取的變化，病理研究癌細(xì)胞Ki-67以及caspase-3的表達(dá)，監(jiān)測(cè)14 d。a）SUDHL-1腫瘤生長(zhǎng)曲線；b）治療前及治療5 d后FDG-PET監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的結(jié)果；c）治療前及治療5 d后FLT-PET監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的結(jié)果；d）腫瘤細(xì)胞中Ki-67以及caspase-3的表達(dá)

在監(jiān)測(cè)mTOR抑制劑靶向治療SUDHL-1淋巴瘤時(shí)，F(xiàn)LT-PET的預(yù)測(cè)效果優(yōu)于FDG-PET

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示mTOR的抑制同樣可以導(dǎo)致SUDHL-1淋巴瘤生長(zhǎng)的停滯（圖3a）、FLT攝取的降低（圖3c）、caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞的增加和Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞的減少（圖3d），但是FDG攝取在治療開(kāi)始5 d后無(wú)顯著變化（圖3b）。因而，實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次表明FLT-PET對(duì)早期療效的評(píng)估及預(yù)測(cè)效果優(yōu)于FDG-PET。

驗(yàn)證FLT-PET在監(jiān)測(cè)腫瘤對(duì)治療反應(yīng)的的預(yù)測(cè)性價(jià)值

為了評(píng)估FLT-PET對(duì)靶向性治療效果的預(yù)測(cè)價(jià)值，使用不同的表達(dá)NPM-ALK淋巴瘤細(xì)胞系Karpas299。與SUDHL-1細(xì)胞不同，Karpas299淋巴瘤顯示出對(duì)AUY922治療的抗性，主要表現(xiàn)為治療組腫瘤的生長(zhǎng)與對(duì)照組相似（圖4a）。相較而言，癌伏妥的治療卻使腫瘤生長(zhǎng)停滯。對(duì)所有Karpas299淋巴瘤小鼠在治療開(kāi)始前以及治療后2 d行FLT-PET。與預(yù)期相符，對(duì)照組和AUY922治療組腫瘤的FLT攝取無(wú)顯著差別（P=0.42），其值分別增至治療前的154%和149%（圖4b）；值得關(guān)注的是在治療開(kāi)始后近2 d的時(shí)間，癌伏妥就導(dǎo)致治療組與對(duì)照組腫瘤FLT攝取的顯著差異（P=0.001），且其預(yù)測(cè)結(jié)果與腫瘤的生長(zhǎng)一致。另外，病理檢測(cè)結(jié)果顯示癌伏妥的治療導(dǎo)致顯著的腫瘤細(xì)胞的死亡（P=0.02），但AU9Y922卻沒(méi)有（P=0.5）；癌伏妥治療組的腫瘤中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞率（37.1%）明顯低于對(duì)照組（59.9%；P=0.02），而AUY922的治療只導(dǎo)致略低于對(duì)照組的細(xì)胞增殖抑制（Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞：45.1%；P=0.1）（圖4d）。因此，表明FLT-PET成像可用于區(qū)分有效與無(wú)效的治療，并對(duì)治療效果有很高的預(yù)測(cè)價(jià)值。

圖3 功能成像FLT-PET在監(jiān)測(cè)HSP90抑制治療SUDHL-1淋巴瘤療效時(shí)比FDG-PET效果更好。當(dāng)攜帶SUDHL-1淋巴瘤的小鼠身上的腫瘤體積達(dá)到500 mm3時(shí)，開(kāi)始癌伏妥的治療（5 mg/kg，口服），測(cè)量腫瘤體積和FLT以及FDG攝取的變化，病理研究癌細(xì)胞Ki-67以及caspase-3的表達(dá)，監(jiān)測(cè)14 d。a）SUDHL-1腫瘤生長(zhǎng)曲線；b）治療前及治療5 d后FDG-PET監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的結(jié)果；c）治療前及治療5 d后FLT-PET監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的結(jié)果；d）腫瘤細(xì)胞中Ki-67以及caspase-3的表達(dá)

圖4 FLT-PET可以在治療早期就分辨有效和無(wú)效治療的反應(yīng)。當(dāng)攜帶Karpars299淋巴瘤的小鼠身上的腫瘤體積達(dá)到500 mm3時(shí)，開(kāi)始AUY922（25 mg/kg，腹腔注射）或者癌伏妥（5 mg/kg，口服）的治療，測(cè)量腫瘤體積和FLT以及FDG攝取的變化，病理研究癌細(xì)胞Ki-67以及caspase-3的表達(dá)，監(jiān)測(cè)14 d。A：Karpas299腫瘤生長(zhǎng)曲線；B：治療前及治療2 d后FLT-PET監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的結(jié)果；C：腫瘤細(xì)胞中Ki-67以 及caspase-3的 表 達(dá)

討 論

隨著淋巴瘤發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展，大量以致病通路為目標(biāo)的靶向性藥物應(yīng)運(yùn)而生［26,27］。為了優(yōu)化臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和治療管理，確定影像學(xué)生物標(biāo)靶的敏感性和有效性至關(guān)重要。并且，這些影像學(xué)生物標(biāo)靶還將大大提高對(duì)有效的聯(lián)合治療方案的驗(yàn)證效率。因?yàn)椋M管在藥效學(xué)理論中認(rèn)定的針對(duì)特定標(biāo)靶的治療會(huì)抑制癌癥的發(fā)展，但在臨床實(shí)踐中未必能夠真正實(shí)現(xiàn)［28］；而且還有許多靶向性藥物的藥效并未經(jīng)驗(yàn)證［29］。僅通過(guò)遺傳譜或致癌途徑無(wú)法對(duì)晚期淋巴瘤患者的靶向治療的藥物療效進(jìn)行預(yù)測(cè)，而常規(guī)影像成像檢測(cè)（如CT或MRI）尚無(wú)法對(duì)治療的有效性進(jìn)行判斷，功能性體內(nèi)成像便可在治療早期評(píng)估和預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)靶向性治療的反應(yīng)。

本研究中以致癌蛋白ALK通路活性為基礎(chǔ)的ALCL細(xì)胞被用來(lái)評(píng)估PET示蹤劑FDG和FLT作為早期監(jiān)測(cè)療效的示蹤劑的可靠性。其中，致癌蛋白ALK的活化是NPM-ALK陽(yáng)性淋巴瘤的特征，并導(dǎo)致PI3K-AKT-mTOR和JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)被激活，這兩個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑是癌細(xì)胞中關(guān)鍵的生存和增殖途徑，并被證實(shí)可作為淋巴瘤等惡性疾病的藥理學(xué)靶標(biāo)［22,30,31］。HSP90蛋白被認(rèn)為是抗癌治療的一個(gè)重要的標(biāo)靶，通過(guò)抑制它的表達(dá)可加速NPMALK以及其他致癌蛋白的降解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［24,32］。癌伏妥作為mTOR抑制劑被用于多種腫瘤的治療［33］。研究顯示FLT的攝取與NPM-ALK或NPM-ALK下游途徑抑制而導(dǎo)致的增殖抑制密切相關(guān)；FLT-PET在監(jiān)測(cè)腫瘤體積產(chǎn)生明顯變化前的早期療效時(shí)比FDG-PET更敏感，更具特異性；而且，針對(duì)于此結(jié)論的細(xì)胞和小鼠腫瘤模型的評(píng)估結(jié)果顯示一致性的結(jié)果。

FDG-PET是在治療結(jié)束后對(duì)侵襲性淋巴瘤進(jìn)行預(yù)后分級(jí)的有效無(wú)創(chuàng)性影像學(xué)方法［5］。但是，在治療期間FDGPET作為監(jiān)測(cè)中期療效的方法對(duì)最終治療結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)其預(yù)測(cè)能力并不理想［10,34］；有研究證明，F(xiàn)DG-PET在預(yù)測(cè)以mTOR抑制為基礎(chǔ)的晚期腫瘤療效時(shí)表現(xiàn)不佳［35］。因此，臨床上亟需一種能夠在治療早期便可反映腫瘤在增殖方面變化的新型影像學(xué)示蹤劑。FLT以S期酶胸苷激酶1（TK1）為基礎(chǔ)的示蹤劑，可在具有增殖能力的細(xì)胞中大量聚集；TK1的活性與細(xì)胞增殖能力相關(guān)，且與細(xì)胞攝取FLT的能力直接相關(guān)，從而使FLT成為反映細(xì)胞增殖情況的 特 異 性 指 標(biāo)［13-15,36］。

FDG在HSP90或mTOR靶向治療早期監(jiān)測(cè)腫瘤（如乳腺癌［37,38］、卵巢癌［39］和胰腺癌［35］）針對(duì)治療反應(yīng)能力不足，這與本研究結(jié)果一致。究其原因，可能是mTOR抑制后48 h內(nèi)可以起炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致FDG攝取的增加［40］。由于炎癥細(xì)胞的FDG攝取與腫瘤細(xì)胞相似甚至偏高，因此炎癥反應(yīng)引起短暫的FDG攝取增加可能導(dǎo)致對(duì)腫瘤代謝活性的過(guò)度估計(jì)［41］，而FLT作為細(xì)胞增殖特異性示蹤劑以用于監(jiān)測(cè)PI3K-AKT-mTOR通 路靶向性 治 療的療效［39,42］。由于抑制NPM-ALK下游信號(hào)通路可導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯于G1期，并且p27增加和細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)減少使TK1活性降低［43］，F(xiàn)LT的攝取又與TK1的活性直接相關(guān)，因此，F(xiàn)LT可有效的監(jiān)測(cè)針對(duì)該致癌途徑的靶向性治療的療效并進(jìn)行預(yù)后分級(jí)。研究證實(shí)FLT-PET在HSP90和mTOR抑制治療5 d后便可反應(yīng)治療引起的FLT攝取的顯著降低；而且腫瘤生長(zhǎng)曲線和病理學(xué) 研究驗(yàn)證了這一結(jié)論，并顯示了癌細(xì)胞增殖的顯著減少和細(xì)胞凋亡的增加。

本課題提出了一個(gè)包括分子層面、細(xì)胞及腫瘤模型綜合分析的轉(zhuǎn)化研究，來(lái)驗(yàn)證PET在早期評(píng)估腫瘤對(duì)靶向治療的反應(yīng)時(shí)的預(yù)測(cè)價(jià)值。本結(jié)果表明FLT-PET作為一種無(wú)創(chuàng)的功能影像學(xué)方法可在治療初期就顯示腫瘤對(duì)靶向性治療的反應(yīng)，此發(fā)現(xiàn)將促進(jìn)針對(duì)NPM-ALK途徑的新型抑制劑效用的快速評(píng)估。

（參考文獻(xiàn)從略）