竹葉椒對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及機制研究

宋彤彤，郭 濤，章聚寶，吳鵬法，魏黎陽，譚素北

（蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

竹葉椒 （Zuuthoxylum urmutumDC.）是常見的藥食兩用植物，蕓香科花椒屬。對竹葉椒的化學成分研究顯示，竹葉椒含有酰胺、生物堿、木脂素、黃酮、香豆素、三萜等成分[1-6]。其中雙四氫呋喃木脂素和喹啉類生物堿是竹葉椒的特征性成分[7]。

糖尿病是由于胰島素分泌不足和胰島素作用缺陷或者兩者共同作用所導致的碳水化合物、脂肪和蛋白質代謝紊亂疾病。α-葡萄糖苷酶是位于小腸刷狀緣的消化碳水化合物的關鍵酶，其是引起餐后血糖升高的主要的酶之一。α-葡萄糖苷酶抑制劑可以延緩所攝入碳水化合物的消化吸收，降低了餐后血糖和胰島素的峰值。抑制α-葡萄糖苷酶的作用成為阻止餐后高血糖的主要治療策略[7-11]。目前臨床應用的α-葡萄糖苷酶抑制劑多是生物合成或半生物合成藥，種類少、價格貴、副作用大[12]。當前從天然產(chǎn)物，尤其是從常用的藥食兩用植物中開發(fā)降血糖的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為研究者關注的熱點[13-14]。作者研究發(fā)現(xiàn)竹葉椒醇提物具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性[15-16]。針對竹葉椒乙醇部位提取物中所含有的生物堿，包括脂溶性和水溶性生物堿，進行有關α-葡萄糖苷酶的研究（抑制作用及作用機理），為竹葉椒資源的進一步的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹葉椒：廣西南寧市售商品；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷：美國Sigma公司產(chǎn)品；二甲亞砜（DMSO）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）：天津市大茂化學試劑廠產(chǎn)品。

試驗動物為清潔級昆明小鼠：體質量20 g左右（合格證號：醫(yī)動字第14.005，小鼠許可證號：SCXK（甘）2013-0002）：購自蘭州大學動物實驗中心。

1.2 儀器與設備

UV-6100S型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；FA2004電子分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 生物堿制備 參照文獻方法[15]，取竹葉椒粉末200 g，在75℃下用體積分數(shù)95%乙醇回流提取2次，每次2 h，過濾后合并濾液，減壓濃縮至粘稠狀且無乙醇味，得乙醇部位提取浸膏。浸膏用蒸餾水混懸，并用質量分數(shù)2%硫酸調節(jié)pH至2，將所得混合物搖勻靜置后抽濾，棄濾渣得酸水液。濃氨水調節(jié)濾液pH至9～10左右后加氯仿萃取得脂溶性生物堿。水層繼續(xù)用2%的NaOH調pH＞12后用正丁醇萃取得水溶性生物堿。提取流程見圖。

圖1 生物堿提取流程Fig.1 Extraction of alkaloid

1.3.2 小鼠小腸α-葡萄糖苷酶的制備 依 據(jù) 文獻方法[17]，頸椎脫位處死小鼠，立即取出小鼠小腸。小鼠腸道內的脂肪組織使用質量分數(shù)0.9%NaCl溶液和10 mmol/mL的磷酸鈉緩沖液PBS（pH 7.0）清洗，洗凈后用剪刀將小鼠小腸縱向切開，將小腸剪碎。加入4℃預冷的磷酸鈉PBS緩沖液（pH 7.0），體積比為1∶3?；旌衔镅心ゾ鶆?，離心，條件是4℃，8 000 r/min，20 min，吸取上清液后分裝，凍藏，溫度為-20℃，以備用。

1.3.3 竹葉椒提取物對α-葡萄糖苷酶活性的影響參照文獻方法[18]并稍做修改。α-葡萄糖苷酶溶液15 μL（10 U／mL）與 30 μL 竹葉椒生物堿（濃度為0.25～5.0 mg/mL）溶液混合均勻后，加入1 860 μL磷酸緩沖液（pH 6.8），將混合液放置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃下孵化20 min，取出后加入30 μL PNPG（濃度為10 mmol/L），再次放入恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃下孵化30 min，取出后添加1 980 μL碳酸鈉（濃度為1 mol/L）以終止酶促反應。立即加入蒸餾水將混合液稀釋到10 mL，利用紫外分光光度計測定其吸光值。分光光度計波長為410 nm。空白組樣品溶液由30 μL磷酸緩沖液PBS代替。每組實驗做3次平行對照。抑制率計算公式如下：

1.3.4 酶抑制動力學 參照文獻方法 [19]，將10 mmol/L PNPG 稀 釋 成 0.25，0.5，1，2，10 mmol/L 溶液。 取在 10 mL 試管中加入 30 μL PNPG，1 260 μL磷酸緩沖液，37℃下恒溫孵化30 min，加入15 μL α-葡萄糖苷酶溶液（10 U/mL），立即在410 nm波長下測定，然后依次用未加生物堿樣品的溶液、2.5 mg/mL竹葉椒脂溶性、2.5 mg/mL水溶性生物堿代替相應的磷酸緩沖液進行測定。再依照Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法研究抑制機理，分析相應的動力學最大速度（Vmax）和米氏常數(shù)（Km）。每組實驗做3次平行對照。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析利用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包進行。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，利用方差分析及LSD法比較各組的IC50值。P值小于0.05被認為具有顯著性差異。

2 結 果

2.1 竹葉椒生物堿對釀酒酵母來源α-葡萄糖苷酶和小鼠小腸來源α-葡萄糖苷酶活性影響

如圖2所示，竹葉椒水溶性生物堿和脂溶性生物堿對α-葡萄糖苷酶都有一定的抑制作用。兩種生物堿在0.25～5.0 mg/mL范圍內，隨著質量濃度的升高，其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用逐漸升高，呈現(xiàn)抑制強度的濃度依賴關系。當質量濃度為5 mg/mL時，水溶性生物堿的抑制率達到50.69%，脂溶性生物堿的抑制率達到67.90%。由圖2可知，每一個測試濃度下，脂溶性生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制作用高于水溶性生物堿的作用。在2～5 mg/mL范圍內脂溶性生物堿與陽性對照相比，無顯著性差異，其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用接近陽性對照。

竹葉椒水溶性生物堿對釀酒酵母來源α-葡萄糖苷酶半數(shù)抑制 IC50值為（2.744±0.285） mg/mL，脂溶性生物堿對α-葡萄糖苷酶半數(shù)抑制IC50值為（0.734±0.173） mg/mL （表 1）。 陽性對照阿卡波糖IC50值為（0.810±0.109） mg/mL。

如圖3所示，竹葉椒水溶性生物堿和脂溶性生物堿對小鼠小腸來源的α-葡萄糖苷酶有很強的抑制作用。兩種生物堿在0.25～5.0 mg/mL的范圍內，其抑制活性與濃度呈正相關性。在質量濃度為10 mg/mL時，水溶性生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制率達到41.10%，脂溶性生物堿為80.60%。每一個對應的質量濃度下，脂溶性生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制作用明顯大于水溶性生物堿的作用。竹葉椒脂溶性生物堿在質量濃度為5～10 mg/mL時，與陽性對照相比無顯著性差異，其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用接近陽性對照。

圖2 竹葉椒生物堿對α-葡萄糖苷酶（釀酒酵母）活性的抑制作用Fig.2 Inhibition of α-glycosidase enzymes of alkaloidfrom Zanthoxylum armatum DC.

圖3 竹葉椒生物堿對α-葡萄糖苷酶（小鼠小腸）活性的抑制作用Fig.3 Inhibition of rat small intestine α-glycosidase enzymes of alkaloid from Zanthoxylum armatum DC.

竹葉椒脂溶性生物堿對小鼠小腸來源α-葡萄糖苷酶半數(shù)抑制 IC50值為（1.944±0.078） mg/mL，而水溶性生物堿在質量濃度達到10 mg/mL時，抑制率仍然沒有達到50%，無法計算IC50值。陽性對照阿卡波糖 IC50值為（0.81±0.11） mg/mL（表 1）。

2.2 竹葉椒生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制機制

選擇5 mg/mL的竹葉椒水溶性生物堿、脂溶性生物堿以及不添加測試樣品的空白對照，分別加入5個不同質量濃度的4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）并測定反應速度。根據(jù)Lineweave-Burk作圖法，以[S]的倒數(shù)為橫坐標，反應速度V的倒數(shù)為縱坐標，繪制竹葉椒生物堿的抑制作用動力學曲線，從圖4中可以看出其近似的斜線交于橫坐標的一點；另一方面，就與縱軸的交點而言，脂溶性生物堿的數(shù)值大于水溶性生物堿，水溶性生物堿數(shù)值大于空白的，即它們的Vm不同，這些結果是典型的非競爭性抑制的特點，說明竹葉椒生物堿與酶與底物的結合物相互作用，對α-葡萄糖苷酶的抑制作用機制屬于非競爭性抑制。

表1 竹葉椒生物堿和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用IC50值比較Table 1 Comparison of extracts and acarbose IC50values of inhibition on α-glycosidase enzymes

圖4 不同底物質量濃度下竹葉椒生物堿的Linweave-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.4 Lineweaver-Burk plot of extracts to the substrate PNPG at different concentration

3 討 論

實驗結果顯示，竹葉椒生物堿對于酵母來源的α-糖苷酶抑制作用高于試驗所制備的小腸來源的α-糖苷酶，一個可能原因是實驗所制備的小腸來源α-糖苷酶樣品除了含有α-糖苷酶，還有α-淀粉酶、蔗糖酶等多種能分解糖的酶。在每個測試濃度下，脂溶性生物堿對α-糖苷酶的抑制作用高于水溶性生物堿。脂溶性生物堿可能是抑制α-糖苷酶的最主要的有效成分，這與脂溶性生物堿在竹葉椒中含量高，生物堿種類多等有密切關系。相關研究[20]也發(fā)現(xiàn)，桑葉生物堿是桑葉抑制α-葡萄糖苷酶的主要有效成分。另有文獻報道[21]，木蘭花堿對α-葡萄糖苷酶抑制作用效果明顯。而這種生物堿也被作者從脂溶性生物堿中分離得到。這些實驗結果進一步證實竹葉椒生物堿類成分，尤其是脂溶性生物堿，可能是其抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性成分之一。

動力學研究表明，竹葉椒生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制機制為非競爭性抑制，說明其通過與酶和底物復合物結合而降低酶活性，達到抑制α-葡萄糖苷酶的作用。

4 結 語

竹葉椒是常用的藥食兩用天然資源，在我國分布廣泛。作者證實竹葉椒生物堿對α-葡萄糖苷酶有良好的抑制作用，并發(fā)現(xiàn)其對α-葡萄糖苷酶的作用機制為非競爭性抑制。后續(xù)深入開展竹葉椒生物堿類單體化合物的分離鑒定以及活性評價，從中發(fā)現(xiàn)高效、新型的生物堿類α-葡萄糖苷酶抑制劑有廣闊前景。