茶園土壤中優(yōu)勢(shì)菌株毛霉菌的分離、純化及鑒定

周小露，劉麗明，宋加艷，宋麗莎，田茂燕，王利榮，周才碧

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長沙 410000；2.黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州都勻 558000；3.黔南州廣播電視大學(xué)物理系，貴州都勻 558000）

貴州是我國唯一兼具低緯度、高海拔、寡日照、多云霧、無污染、全境高原的茶區(qū)，截至2017年底，全省茶園面積為47.84萬hm2，其中，黔南州的種植面積為10.73萬hm2，占貴州省茶園總面積的21%，是重要茶區(qū)之一。黔南州《關(guān)于進(jìn)一步加快推進(jìn)茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的意見》中提出了有機(jī)茶的發(fā)展方向，其關(guān)鍵是增加茶樹專用有機(jī)肥的使用。

目前，使用化肥已造成貴州部分地區(qū)茶園土壤酸化以及茶樹植株矮小、產(chǎn)量降低等問題[1-2]。農(nóng)作物秸稈內(nèi)含有大量的有機(jī)物，不僅可以增加土壤的有機(jī)含量、補(bǔ)充大量元素，而且是最常見的能作為生物有機(jī)肥的原料之一。生物有機(jī)肥制作使用的是天然原料，比如秸稈、微生物、腐殖質(zhì)等，通過有效菌種發(fā)酵產(chǎn)生的多種可溶性生理活性物質(zhì)，如有機(jī)酸、維生素等，能被植物迅速吸收，從而達(dá)到改善土壤質(zhì)量的目的。施用有機(jī)肥[3-7]可降低土壤的酸化程度，有利于加快土壤中氮、磷等元素循環(huán)[8-11]，有助于緩解土壤酸化趨勢(shì)[12-14]，減少Cd等[15]重金屬的累積；促進(jìn)茶樹提早萌發(fā)[16]，茶葉長勢(shì)良好，芽葉密度大，百芽質(zhì)量明顯增加，還可增加茶鮮葉中的茶多酚、咖啡堿、水浸出物、可溶性糖的含量，明顯降低茶葉氟含量。

土壤是植物吸收養(yǎng)分的主要來源之一，通過施肥能改良茶樹因缺少大量元素帶來的葉片發(fā)黃等問題。茶樹專用有機(jī)肥既可作基肥又可作追肥，速效與緩效養(yǎng)分協(xié)調(diào)、肥料利用率高，可減輕土壤中硝酸鹽積累以及磷鉀肥造成的重金屬污染。因此，茶園專用有機(jī)肥的研制具有非常重要的意義。

本試驗(yàn)以黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，分離、純化得到優(yōu)勢(shì)菌株，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定，旨在明確優(yōu)勢(shì)菌株的種屬關(guān)系，為茶園專用有機(jī)肥的開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為土樣，采集于貴州省黔南州都勻市三江堰茶園。

1.2 試劑與儀器

蔗糖、七水合硫酸鎂、七水合硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀（壽光市艾益農(nóng)生物科技有限公司），硝酸鈉（北京化工廠），氯化鉀（天津市福晨化學(xué)試劑廠），均為分析純；瓊脂粉（壽光市艾益農(nóng)生物科技有限公司）。

試驗(yàn)儀器為電子顯微鏡（XSP-8C，德卡精密量儀有限公司）；電子天平（LTI000B，常熟市天量儀器有限責(zé)任公司）；恒溫培養(yǎng)箱（BIC-250，德卡精密量儀有限公司）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ1FDA，德卡精密量儀有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（GI54DS，致微儀器有限公司）；冰箱（BCD-251WBSV，常熟市天量儀器有限責(zé)任公司）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制 參考周才碧等[17]的方法，按試驗(yàn)要求進(jìn)行適當(dāng)修改。PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂粉20 g。WA培養(yǎng)基：瓊脂粉13 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3.2 菌株分離培養(yǎng) 稱取20 g茶園土樣放入三角瓶，加入80 mL無菌水，搖勻制備成菌種懸液，并將其稀釋成不同濃度菌種溶液，備用。再用接種環(huán)蘸取不同稀釋濃度的菌種懸浮液1～2滴，采用涂布法接種于PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋濃度做6個(gè)重復(fù)；將PDA培養(yǎng)基放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6～7 d，有菌落形成時(shí)，即對(duì)菌株進(jìn)行純化處理。

1.3.3 菌株純化培養(yǎng) 待培養(yǎng)基上的菌落培養(yǎng)6 d、可以明顯觀察到菌落時(shí)，挑選生長旺盛菌落，用平板劃線法接種到PDA培養(yǎng)基上；并將培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待菌落長出較多時(shí)，繼續(xù)劃線純化，直到純化出單一菌落。

1.3.4 菌株形態(tài)特征觀察 利用電子顯微鏡對(duì)菌種菌落的孢子囊、分生孢子、厚垣孢子及生長速率等形態(tài)特征進(jìn)行觀察記錄，以對(duì)該菌種菌落的類型進(jìn)行初步判斷。

1.3.5 菌株生長速率測(cè)定 在無菌環(huán)境下，把優(yōu)勢(shì)菌株打成直徑為5 mm的菌餅，再轉(zhuǎn)移至25℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d，量取菌落直徑并再次記錄其特征。

1.3.6 菌株分子生物學(xué)鑒定

1.3.6.1 DNA的提取 挑取約1 mg優(yōu)勢(shì)種菌絲，研磨，依次加入 500 μL 裂解液，150 μL KAC，50 μL異丙醇，反復(fù)離心15 min；收取上清液，加等體積70%的乙醇，離心10 min；等待水分散失，加0.1×TE 30 μL，收集上清液得優(yōu)勢(shì)種菌絲DNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，紫外分光光度法檢測(cè)DNA的濃度，再稀釋至30～50 ng/μL，備用。

1.3.6.2 PCR擴(kuò)增 用于引物篩選的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為 25 μL：1 μL DNA 模板，10×buffer的緩沖液體 2.5 μL，dNTPs2 μL，正反向引物各 1 μL，ExTaq DNA聚合酶 0.1 μL，ddH2O17.4 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)32次；最后72℃延伸5min；12℃保存?zhèn)溆?。以通用引物ITS4（5′-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′，蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，4℃冰箱保存PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所得序列提交到National Center for Biotechnology Information（NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫，通過 BLAST 程序，將28SrDNA序列與GeneBank中的核酸序列進(jìn)行對(duì)照，并從數(shù)據(jù)庫中獲得相關(guān)序列。采用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用Neighbor-Joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹，確定菌株類別。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)菌株的分離、純化

以茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，利用稀釋涂布分離得到5種菌；進(jìn)一步利用平板劃線純化該菌株，最終得到優(yōu)勢(shì)菌株S1（圖1），該菌株在25℃，PDA培養(yǎng)基中生長旺盛，生長周期較長。

2.2 目標(biāo)菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的方法，對(duì)2.1分離、純化得到的菌株S1進(jìn)行觀察。利用電子顯微鏡觀察，優(yōu)勢(shì)菌S1特征鮮明，易識(shí)別，菌落大、質(zhì)地疏松、不透明、白色絨毛、菌絲無隔、多核、分枝狀，孢子呈橢圓形，在培養(yǎng)基內(nèi)廣泛蔓延。根據(jù)菌株S1的菌落和孢子形態(tài)等特征，初步推斷該菌屬為毛霉菌（圖 2）。

2.2.2 分子鑒定 提取菌株S1的DNA，進(jìn)行凝膠電泳及PCR擴(kuò)增，得到1條515bp的清晰條帶（圖3）；將此PCR產(chǎn)物測(cè)序后提交到 GenBank中，經(jīng)BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)菌S1的rDNA-ITS序列與Rhizomucor（KX343955.1）的序列相似度高達(dá) 99%。依據(jù)比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），結(jié)果表明，該菌應(yīng)歸為Rhizomucor，結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定，確定從茶園土壤中分離純化出的菌為毛霉菌。

毛霉菌（Mucor）的具體分類地位如下：

——真菌界Mycota

——接合菌亞門Zygomycoina

——接合菌綱Zygomycetes

——毛霉目Mucorales

——毛霉屬Rhizomucor

——毛霉菌Mucor

3 結(jié)論與討論

以黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，進(jìn)行稀釋，并將樣品懸液涂布于培養(yǎng)皿培養(yǎng)得到多種菌種，又對(duì)菌種進(jìn)行分離，再挑取菌種純化得到優(yōu)勢(shì)菌株。

為了明確優(yōu)勢(shì)菌株的種屬關(guān)系[18]，本研究對(duì)于優(yōu)勢(shì)菌株的鑒定首先采用傳統(tǒng)的生物形態(tài)學(xué)鑒定法，利用電子顯微鏡進(jìn)行觀察，初步確定該優(yōu)勢(shì)菌株為毛霉屬；其次，對(duì)于優(yōu)勢(shì)菌株采用ITS序列（分子）鑒定法，確定其為毛霉菌。

毛霉菌可有效地轉(zhuǎn)化腺嘌呤[19]、產(chǎn)生脂肪酶[20]和不對(duì)稱還原4-甲基苯乙酮[21]，在工農(nóng)業(yè)上有著極高的利用價(jià)值，且分解能力較強(qiáng)，是有機(jī)肥目標(biāo)菌株之一。