有氧運動干預(yù)父系C57BL/6J小鼠對雄性子代骨骼肌mTOR信號通路的影響

于春霞 王巍 褚曉蕾 傅力

1 天津醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理生理學(xué)系（天津 300070）

2 天津市天津醫(yī)院康復(fù)科（天津 300210）

骨骼肌約占哺乳動物體重的40%，是維持機體餐后血糖、促進葡萄糖攝取利用的最大組織器官[1]。骨骼肌含量降低可導(dǎo)致多種代謝紊亂的發(fā)生，包括肥胖和胰島素抵抗[2，3]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of Rapamycin，mTOR）是哺乳動物細胞內(nèi)感受細胞外運動刺激、營養(yǎng)狀態(tài)等信號變化的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，包含兩種蛋白復(fù)合物mTORC1和mTORC2。當(dāng)細胞外環(huán)境發(fā)生變化時，mTOR能夠激活下游的效應(yīng)蛋白核糖體蛋白S6激酶1（Ribosomal Protein S6 Kinase 1，S6K1）參與調(diào)節(jié)細胞生長、分化增殖以及蛋白質(zhì)合成過程[4]。骨骼肌是人體最大的組織，機械制動小鼠后肢7天后可顯著降低小鼠后肢肌肉質(zhì)量，同時骨骼肌細胞mTOR信號通路及真核翻譯起始因子（eIF）4E結(jié)合蛋1（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4E-BP1）的合成顯著下降[5]。給制動小鼠后肢注射雷帕霉素則顯著抑制小鼠骨骼肌中p70S6K（Thr389）磷酸化水平，進一步加重小鼠后肢骨骼肌萎縮程度[5]。而規(guī)律有氧運動可有效激活骨骼肌mTOR信號通路，雄性SD大鼠經(jīng)1周跑臺運動干預(yù)，其腓腸肌蛋白質(zhì)合成水平、Akt（Ser473）、mTOR（Ser2448）、p70S6K（Thr389）和 4E-BP1（Thr37/46）磷酸化蛋白的表達及4E-BP1蛋白表達均顯著高于安靜對照組大鼠[6]。提示mTOR信號通路的激活是促進骨骼肌蛋白合成的關(guān)鍵因素[6]。然而，以上研究多局限于運動干預(yù)對實驗對象本身的影響，而運動干預(yù)親代對其子代影響的研究尚不多見[7]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，父母的生活方式及生活環(huán)境均可對子代健康產(chǎn)生深遠影響[8]。母親孕期或哺乳期肥胖會顯著增加后代代謝綜合征[9]的發(fā)病率，并降低后代的學(xué)習(xí)及運動能力[10]。而母親孕期規(guī)律的游泳訓(xùn)練，可有效降低后代的疾病易感性[11，12]，然而關(guān)于運動干預(yù)父系小鼠對后代健康的影響卻鮮見報道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食/有氧運動干預(yù)父代C57BL/6小鼠能夠?qū)ζ渥哟?、脂代謝及學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生影響，但僅限于雄性子代[13]。關(guān)于干預(yù)親代對后代健康影響存在性別差異的觀點，Gilbert等研究也認為可能與兩性胚胎對發(fā)育環(huán)境的適應(yīng)性及雌雄激素對疾病發(fā)生發(fā)展的影響不同所致[14]。在人類及動物研究中發(fā)現(xiàn)，性別所導(dǎo)致的表型差異可能受胎盤基因表達的影響，而胎盤基因表達位于X染色體的基因相對較少[14]，這也進一步佐證干預(yù)父系小鼠對其雌性后代某些表型影響較小的可能原因。因此，本研究以C57BL/6J小鼠為實驗對象，通過對父系小鼠進行6周跑臺運動干預(yù)，選擇雄性F1代小鼠的體重、骨骼肌濕重、骨骼肌濕重/體重比值、骨骼肌抓力/體重比值及骨骼肌mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白表達的差異，探究運動干預(yù)父系小鼠對雄性子代小鼠骨骼肌mTOR信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)

8周齡健康C57BL/6J小鼠20只（雌雄各10只），體重為24～27 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司。分籠飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)無特定病原體（SPF）實驗動物中心。室內(nèi)環(huán)境溫度維持在20°C～25°C，相對濕度為40%～60%，給予正常小鼠飼料、自由進食水，光照12小時/天。

1.2 動物分組與運動模型建立

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取雌、雄小鼠按1∶1合籠，次日晨檢查雌鼠外陰處精栓，如發(fā)現(xiàn)精栓后將雄鼠移出，孕鼠單獨飼養(yǎng)至分娩。新生鼠（F0）母乳喂養(yǎng)21天后斷乳，每窩選取3只雄性小鼠為F0代運動組，另3只同窩雄性小鼠為F0代安靜組。運動組小鼠首次跑臺訓(xùn)練速度為8 m/min，隔天遞增至12 m/min（強度相當(dāng)于75%VO2max）[15]適應(yīng)性訓(xùn)練1周。之后連續(xù)進行6周跑臺運動干預(yù)：5次/周，1次/天，60 min/次[16]。6周跑臺干預(yù)后，運動組和安靜組小鼠分別與同窩未干預(yù)的雌性小鼠按1∶1合籠交配。次日晨檢查雌鼠外陰處精栓，如發(fā)現(xiàn)精栓后將雄鼠移出，孕鼠單獨喂養(yǎng)至分娩。分娩后的小鼠為F1代。分別從F0代安靜組與運動組小鼠中各選取6只F1代雄性小鼠分為安靜組（CM）和運動組（EM）作為本實驗研究對象。

1.3 抓力測試

稱量并記錄CM和EM組小鼠體重后逐一進行抓力測試：校準抓力測試儀后按下測定鍵，將小鼠置于抓力板上，抓住鼠尾輕輕后拉，待小鼠抓牢抓力板后，均勻用力后拉，儀器自動記錄小鼠的抓力值，測量3次取平均值即為該只小鼠的抓力大小。為了比較的標準化，小鼠抓力測試結(jié)果以抓力/體重作為評定標準。

1.4 處死小鼠及組織留取

抓力測試結(jié)束后，小鼠禁食14～16小時，自由飲水。動物處死前稱重，處死后，分離小鼠股四頭肌，一側(cè)置于4%多聚甲醛內(nèi)固定，用于HE染色。另一側(cè)組織迅速置于液氮中，后轉(zhuǎn)入－80°C冰箱保存。

1.5 股四頭肌組織學(xué)檢測

股四頭肌置4%多聚甲醛內(nèi)固定24～48 h，隨后轉(zhuǎn)置30%蔗糖溶液中脫水，OCT包埋，切片；脫蠟，水化，蘇木精染色，鹽酸酒精分化，自來水沖洗，脫水，透明，封片。每組隨機選取6個標本，分別選取12張切片，每張切片隨機選取5個視野，計算該切片骨骼肌橫截面積。

1.6 Western Blot方法檢測股四頭肌組織PI 3 K、Akt、mTOR、 S 6 K 1以及 4E-BP 1蛋白及相應(yīng)磷酸化蛋白的表達水平

NP-40法提取骨骼肌組織蛋白。每100 mg組織加入裂解液500 μl，1×Protease Inhibitor 4 μl和1×Phosphatase Inhibitor 4 μl，研磨器充分研磨組織，然后于4°C，12000 g離心40分鐘，取上清，BCA法測定蛋白濃度后轉(zhuǎn)置－80°C冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

依據(jù)BCA法所測的蛋白濃度，在上樣孔內(nèi)加入等量的總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1小時后，將膜與含有5%BSA的抗體稀釋液稀釋的一抗4°C孵育過夜（實驗選用一抗分別為抗 S6K1、PI3Kp85（Tyr458）、Akt，pAkt-Ser473、pmTOR-Ser2448、p4E-BP1-Thr37/46抗體購自CST公司；mTOR、pS6K1-Thr389購自Abcam公司）。次日用1×TBST洗膜3次，每次10分鐘；用5%BSA溶液稀釋二抗（實驗選用二抗為HPR標記山羊抗兔IgG和HPR標記的山羊抗小鼠IgG購自CST公司），室溫孵育1小時，再用1×TBST洗膜3次，每次10分鐘；最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑和X光片檢測蛋白信號。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)由SPSS統(tǒng)計軟件（SPSS13.0 for Windows）處理，計算均值和標準差（±s），采用獨立樣本t檢驗，各組間差異性檢驗的顯著性水平定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 表型實驗結(jié)果

F1代小鼠表型差異如表1所示，與CM相比，EM組小鼠體重、股四頭肌濕重、股四頭肌濕重/體重及抓力/體重比值分別增加了12.76%、23.50%、9.73%及21.50%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示跑臺運動干預(yù)父系小鼠促進了F1代雄性小鼠骨骼肌發(fā)育。

表1 各組F1代雄性小鼠表型的比較（ n=6）

2.2 HE染色

光學(xué)顯微鏡觀察小鼠骨骼肌HE染色結(jié)果如圖1A所示。HE染色結(jié)果經(jīng)Image J軟件分析，顯示EM組小鼠股四頭肌細胞橫截面積較對照組增加30.26%（圖1B，P＜0.05）。

圖1 F1代小鼠股四頭肌纖維HE染色結(jié)果分析（400×）

2.3 F1代雄性小鼠股四頭肌PI3K、Akt、mTOR、S6K1及p4E-BP 1蛋白及磷酸化蛋白表達水平

F1代雄性小鼠股四頭肌PI3K、Akt、mTOR、S6K1以及p4E-BP1蛋白及其磷酸化蛋白表達水平（圖2，3，4）。與CM組相比，EM組小鼠股四頭肌組織PI3K、Akt、mTOR 以及S6K1蛋白表達水平均有所增加，但均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；而pAkt，pmTOR，pS6K1以及p4E-BP1蛋白的表達水平較對照組相比均顯著增加（P＜0.05）。

圖2 F1代雄性小鼠股四頭肌組織PI3K及p4E-BP1蛋白的表達水平

圖3 F1代雄性小鼠股四頭肌組織S6K 1以及相應(yīng)磷酸化蛋白的表達水平

圖4 F1代雄性小鼠股四頭肌組織Akt、m TOR以及相應(yīng)磷酸化蛋白的表達水平

3 討論

骨骼肌作為機體最大的內(nèi)分泌器官之一，可通過多種信號通路與各個器官組織（肝臟、胰腺、脂肪組織等）進行信息傳遞，以維持機體代謝穩(wěn)態(tài)[17]。研究證實，mTOR信號通路在骨骼肌生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用[4]，然而，關(guān)于有氧運動干預(yù)父系對子代骨骼肌mTOR信號通路的影響目前未見報道。本實驗通過對父系C57BL/6J小鼠進行6周跑臺運動干預(yù)，通過記錄其子代體重、股四頭肌濕重及股四頭肌濕重/體重比值、抓力測試、股四頭肌H&E染色，并檢測子代小鼠骨骼肌mTOR信號通路的活性發(fā)現(xiàn)，父系6周跑臺訓(xùn)練可顯著增加子代雄性小鼠骨骼肌的重量、股四頭肌橫截面積及抓力。此外，運動組小鼠子代股四頭肌組織PI3K、Akt、mTOR、S6K1以及4E-BP1蛋白表達水平較對照組均有所增加，其中Akt、mTOR、S6K1以及4EBP1磷酸化蛋白表達水平較對照組顯著提高，提示運動干預(yù)父系小鼠增加雄性子代骨骼肌體積可能與子代骨骼肌mTOR信號通路活性增強有關(guān)。

3.1 親代所處的環(huán)境因素對后代的影響

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近30年來全球兒童及青少年罹患超重或肥胖癥的概率較之前增加3～6倍[18]。其中，70%的發(fā)病原因來自于遺傳[19]，而環(huán)境因素對表觀遺傳的修飾可能是引起幼年代謝紊亂的重要原因[20]。傳統(tǒng)觀念認為，母親自身及孕期所處的生活環(huán)境及生活方式對后代健康影響至關(guān)重要。而如今，越來越多的研究表明，父親的生活方式及生活環(huán)境對后代的影響也極為顯著[21]。例如，Dorosty等發(fā)現(xiàn)，父母雙方均為健康體重的情況下，后代發(fā)生肥胖的概率僅為24%，而當(dāng)父親單方肥胖時，后代罹患肥胖癥的概率可增至67%[22]。運動作為減脂減重，促進健康的重要手段，孕婦孕期規(guī)律的運動訓(xùn)練可顯著降低后代發(fā)生肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病風(fēng)險，而運動干預(yù)父親對子代健康影響的研究并不多見[23]。Murashov等在對雄性小鼠進行了12周自主跑輪訓(xùn)練干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)其子代小鼠在高脂飲食誘導(dǎo)下較對照組子代體重增長速度更慢，且血清葡萄糖及胰島素水平也更低。此外，父系小鼠的長期運動干預(yù)也可顯著提高子代小鼠骨骼肌糖基轉(zhuǎn)移酶（O-GlcNAc transferase，Ogt）、糖苷酶（O-GlcNA-case，Oga）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 4（glucose transporter 4，GLUT4）等代謝基因的表達[21]。與此相似，Krout等通過對雄性小鼠進行高脂飲食和/或跑輪運動干預(yù)12周后與同窩雌鼠交配，獲取的雄性子代斷乳后持續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)12周后發(fā)現(xiàn)，兩組雄性子代小鼠體脂含量并無顯著差別，而運動組子代小鼠血清葡萄糖含量較對照組顯著降低，推測可能與運動組子代小鼠骨骼肌GLUT4、胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinases，PI3K）等胰島素信號分子高表達有關(guān)[23]。以上結(jié)果提示，父系飲食因素可顯著影響后代對疾病的易感性，同時也為揭示父系生活方式可能影響其后代表型提供了寶貴線索。

3.2 6周有氧跑臺運動干預(yù)父系小鼠對子代雄性小鼠骨骼肌 mTOR信號通路的影響

骨骼肌具有高度的可塑性，作為機體最大的蛋白質(zhì)儲存庫，骨骼肌蛋白質(zhì)代謝是機體適應(yīng)運動訓(xùn)練過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前對這種適應(yīng)機制的研究主要集中于骨骼肌內(nèi)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控[24]。研究證實，運動促進骨骼肌肥大的主要信號通路為PI3K/Akt/mTOR途徑[24]。PI3K/Akt/mTOR信號通路的信號分子主要包括PI3K，Akt，mTOR，S6K1和4E-BP1。S6K1和4EBP1是其下游的主要作用靶物，mTOR的促合成效應(yīng)主要通過促進其下游的S6K1和4E-BP1磷酸化實現(xiàn)的[23]。研究表明，S6K1和4E-BP1與骨骼肌蛋白質(zhì)合成直接相關(guān)[25]，小鼠全身敲除S6K1后可導(dǎo)致骨骼肌顯著萎縮[26，27]。同樣，直接磷酸化S6K1和4E-BP1可顯著促進小鼠蛋白合成進而誘導(dǎo)其骨骼肌肥大[28]。本實驗通過對父系小鼠進行6周跑臺運動干預(yù)，發(fā)現(xiàn)F1代雄性小鼠股四頭肌橫截面積及其股四頭肌中PI3K、Akt、mTOR、S6K1以及4E-BP1蛋白表達水平較對照組均有所增加，其中Akt、mTOR、S6K1以及4E-BP1磷酸化蛋白表達水平較對照組增加顯著?？紤]到父系遺傳對雌、雄子代影響的差異性[14]，并結(jié)合我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，父系6周跑臺訓(xùn)練干預(yù)可增強子代雄性小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，推測可能與子代雄性小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目的增加有密切關(guān)系，雄性子代海馬組織內(nèi)BDNF、Reelin基因和蛋白表達增加影響海馬神經(jīng)元數(shù)目，從而提高學(xué)習(xí)記憶能力，但對雌性子代影響效果不明顯[13]。關(guān)于干預(yù)親代對后代健康影響存在性別差異的觀點，Gilber等認為可能與兩性胚胎對發(fā)育環(huán)境的適應(yīng)性及雌雄激素對疾病發(fā)生發(fā)展的影響不同所致[14]。性別導(dǎo)致的表型差異可能受胎盤基因表達的影響，而胎盤表達位于X染色體的基因相對較少[14]，這也進一步佐證父系干預(yù)對雌性后代某些表型影響較小的可能原因。因此，本研究在對父系小鼠進行6周跑臺運動干預(yù)后，通過對比子代雄性小鼠體重、骨骼肌濕重、骨骼肌濕重/體重比值、骨骼肌抓力/體重比值后發(fā)現(xiàn)，父系運動干預(yù)有效促進了雄性子代的生長發(fā)育。因此后續(xù)實驗將著重探究父系運動干預(yù)對雄性子代骨骼肌mTOR信號通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，父系6周有氧跑臺訓(xùn)練增加了子代雄性小鼠股四頭肌組織PI3K、Akt、mTOR、S6K1以及4E-BP1蛋白表達，其中Akt、mTOR、S6K1以及4E-BP1磷酸化蛋白表達水平較對照組顯著增加，提示運動干預(yù)父系小鼠可能通過激活子代雄性小鼠股四頭肌組織mTOR信號通路促進相關(guān)分子磷酸化蛋白的表達，促進蛋白質(zhì)合成，進而促進子代雄性小鼠骨骼肌肥大，增加骨骼肌的濕重及抓力。

4 結(jié)論

長期有氧運動干預(yù)父系小鼠可顯著增加其雄性子代的體重、股四頭肌濕重，增加骨骼肌橫截面積及抓力，其原因可能與運動干預(yù)父系影響了雄性子代小鼠骨骼肌mTOR信號通路活性有關(guān)。