鐵皮石斛水提取物對(duì)糖尿病小鼠腸道微生物及脂類(lèi)代謝的影響

姚堯，趙路，李軍珂

(鄭州市婦幼保健院，河南 鄭州 450053)

近年來(lái)隨著生活節(jié)奏加快及飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，糖尿病的發(fā)病率逐年遞增，據(jù)統(tǒng)計(jì)截止2017年底我國(guó)糖尿病人口約2億人。糖尿病患者常有“三多一少”的癥狀，及多飲多食多排但體重下降，在病理生理表現(xiàn)上不僅表現(xiàn)為血糖升高，同時(shí)影響蛋白質(zhì)和脂肪的代謝[1]。并且血糖持續(xù)異常增高，同時(shí)由于其對(duì)腸道細(xì)胞的影響也間接改變了患者體內(nèi)腸道菌群的生長(zhǎng)環(huán)境，以及增殖所需要的必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生改變。中醫(yī)將糖尿病歸為消渴癥范疇，提出“養(yǎng)陰生津、平衡陰陽(yáng)”為主的療法，與傳統(tǒng)西醫(yī)治療相比較可以減少藥物不良反應(yīng)，在臨床上常與西藥搭配使用，效果顯著。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載， 鐵皮石斛具有“補(bǔ)五臟虛勞羸弱、強(qiáng)陰”功效，可用于陰傷津虧，口干煩渴等，可以改善患者飲食過(guò)度，消耗過(guò)大的情況，并有利于改善其體內(nèi)糖類(lèi)代謝[2]。為探討鐵皮石斛水提取物對(duì)糖尿病小鼠腸道微生物及脂類(lèi)代謝的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)藥物

鐵皮石斛根由浙江中藥材基地提供。洗凈后，機(jī)械粉碎，使用95%乙醇室溫下溶解提取，提取物再于沸水中浸浴3 h，最后蒸發(fā)濃縮，于冰柜中冷凍得鐵皮石斛水提物。

1.1.2 主要試劑

1)1% STZ(鏈脲霉素)：由2.1 g檸檬酸溶于100 mL ddH2O配得檸檬酸母液，由2.94 g檸檬酸三鈉溶于100 mL ddH2O配得檸檬酸三鈉母液。使用前將檸檬酸母液和檸檬酸三鈉母液按照1∶1.32比例配置，避光，冷藏條件下保存。2)總膽固醇(TC)試劑盒(湖南永和陽(yáng)光科技有限責(zé)任公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為YZB/湘0065-2006)；甘油三酯(TG)試劑盒(湖南永和陽(yáng)光科技有限責(zé)任公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為YZB/湘0066-2006)；高密度脂蛋白(HDL-C)試劑盒(湖南永和陽(yáng)光科支有限責(zé)任公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為YZB/湘0067-2006)；低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒(湖南永和陽(yáng)光科技有限責(zé)任公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為YZB/湘0068-2006)。3)PBS磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline)。4)TE緩沖液(Tris-EDTA buffer solution)是由Tris(三羥甲基氨基甲烷)和EDTA(乙二胺四乙酸)配制而成，主要用于溶解核酸，能穩(wěn)定儲(chǔ)存DNA和RNA。5)蛋白酶K 、溶菌酶 、Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇 、70%乙醇、丙酮、 10% SDS(十二烷基硫酸鈉)。6)HhaⅠ酶：識(shí)別位點(diǎn) GCG^C、C^GCG；RsaⅠ酶：識(shí)別位點(diǎn)GT^AC、CA^TG；Hind Ⅲ酶：識(shí)別位點(diǎn)A|AGCTT。

1.1.3 主要試驗(yàn)儀器

PCR儀、-80℃低溫冰箱(海爾 BW-86L388)、冷凍離心機(jī)(Eppendorf，Centrifuge 5415R)、全自動(dòng)生化儀(Siemens-Advia2400型，德國(guó)拜耳)和電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精密實(shí)備有限公司，DNP-9162)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.2.1 動(dòng)物選擇

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供小鼠60只(經(jīng)過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批和同意)，體質(zhì)量18～22 g，均為雌性。保持飼養(yǎng)房通風(fēng)良好， 燈光照明12 h/d，溫度21℃～26℃，濕度60%～70%。

1.2.2 模型制備

參照相關(guān)文獻(xiàn)[3]，小鼠60只,在適宜溫度和光照下飼養(yǎng)1天觀察有無(wú)異常表現(xiàn)小鼠。從中隨機(jī)選10只小鼠作為正常對(duì)照組。剩下的50只小鼠禁食12 h后按每公斤體質(zhì)量向小鼠腹腔內(nèi)注射 STZ(鏈脲霉素)溶液120 mg 。隨后每天上午10點(diǎn)開(kāi)始給小鼠腹腔內(nèi)注射 STZ溶液，共注射3 d，第 4天測(cè)小鼠空腹血糖值，數(shù)值未達(dá)到要求的小鼠繼續(xù)屬蛇STZ 溶液2天，按每公斤體質(zhì)量小鼠注射100 mg。第 6天時(shí)停止喂養(yǎng)飼料12 h后，再次測(cè)量小鼠空腹血糖值，當(dāng)數(shù)值超過(guò)11.1 mmol/L時(shí)為合格模型小鼠。數(shù)值未達(dá)到的小鼠淘汰出組，最后剩余小鼠41只。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

建模成功的小鼠中隨機(jī)選取10只作為模型對(duì)照組，10只為鐵皮石斛水提取物高劑量組(6 g/mL)、10只為鐵皮石斛水提取物低劑量組(1.5 g/mL)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

正常對(duì)照組和模型對(duì)照組的小鼠采用普通飼料正常喂養(yǎng)，同時(shí)每天灌胃0.2 mL生理鹽水。鐵皮石斛水提取物高劑量組和低劑量組(6 g/mL、1.5 g/mL)，在正常飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上，每天在0.2 mL生理鹽水中各加入1.2 g和0.3 g鐵皮石斛提取物，將其灌入小鼠胃中，1次/d，連續(xù)給藥21 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有小鼠均自由喂水，飲用蒸餾水。每5只老鼠飼養(yǎng)于一個(gè)籠子中，每3 d更換一次墊料，保持籠內(nèi)衛(wèi)生清潔。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 小鼠脂類(lèi)代謝檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)用藥結(jié)束后，停止喂養(yǎng)飼料8 h但是仍提供清潔水。取小鼠眼球后血液，注意保證取血時(shí)捆綁好小鼠四肢，防止血液被污染。取約1.5 mL血液于EP管中，靜置30 min，再冷藏。隔天將血液進(jìn)行離心，時(shí)間10 min，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為3 000 r/min,結(jié)束后取其上層透明血清。使用儀器測(cè)血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)含量。

1.4.2 腸道微生物檢測(cè)

1)小鼠腸道微生物提取：檢測(cè)完血清脂代謝物后，4組小鼠采用頸椎脫臼法處死并置于無(wú)菌工作環(huán)境中，無(wú)菌采集各組盲腸段內(nèi)容物，同組隨機(jī)將小鼠兩兩分組，收集其腸內(nèi)容物，充分搖勻過(guò)程中注意保證內(nèi)容物不受污。每組共 10只小鼠，5個(gè)重復(fù)。立即保存在-20℃的冰箱中。

2)小鼠腸道微生物檢測(cè)[4]：在保證樣本不受污染的情況下取約0.1 g小鼠腸道內(nèi)容物。按照分組將標(biāo)本裝入個(gè)樣本瓶中，并在瓶中放入無(wú)菌玻璃珠幫助振蕩。搖床振蕩時(shí)間為35 min，頻率采用160 rpm。 樣本得到徹底振蕩后，將樣本與各個(gè)菌群及稀釋液混合培養(yǎng)， 其中樣本和大腸菌群在 37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)算其菌落數(shù)量，真菌則為32℃培養(yǎng)溫度，時(shí)間延長(zhǎng)至96 h，乳酸菌和雙歧桿菌培養(yǎng)溫度不變，培養(yǎng)環(huán)境中將空氣抽出，培養(yǎng)時(shí)間也為48 h?；旌吓囵B(yǎng)每組進(jìn)行3次，去3次平均值為每克樣本中好用的菌落數(shù)量。

3)腸道菌群宏基因組提?。簠⒄瘴墨I(xiàn)[5]進(jìn)行。離心管中加入1.0 g樣品，過(guò)程中注意避免污染。隨后使用配置好的0.1 mol/L的PBS溶液，用量為20 mL，和無(wú)菌玻璃球一起與樣本混合并成分搖勻。離心時(shí)間2 min 后取上清，重復(fù)以上步驟2次；合并上清液，10 000×g離心8 min，獲得沉淀物；沉淀物使用PBS溶液洗滌1次、丙酮洗滌1次后，加入于5 mL TE 緩沖液(pH值8.0)中重新靜置，用于下步操作。取 500 μL預(yù)處理后的樣本懸液與40 μL TE緩沖液、5 μL蛋白酶K和20 μL溶菌酶成分混勻，加入無(wú)菌離心管。37℃反應(yīng)30 min后加入30 μL 10% SDS，混勻，保持溫度不變?cè)俅巫饔?0 min，并且其中每隔10 min 振蕩。分別加入100 μL 5 mol/L NaCl，80 μL CTAB/NaCl，混勻，65℃反應(yīng)10 min。加入等體積 Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，體積比)，10 000×g離心3 min，取上清；再加入等體積氯仿:異戊醇(24∶1，體積比)，10 000×g 離心3 min，取上清，重復(fù)操作一次。加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉及2倍體積無(wú)水乙醇，-20℃沉淀12 h。沉淀用95%乙醇洗滌1次，風(fēng)干后溶于50 μL TE緩沖液，-20℃保存待用。

4)PCR產(chǎn)物限制性酶切片段分析：以 HhaⅠ、RsaⅠ和Hind Ⅲ酶切PCR產(chǎn)物，反應(yīng)體系為：PCR產(chǎn)物10 μL，ddH2O 12 μL，10×Buffer 2 μL，HhaⅠ、RsaⅠ和Hind Ⅲ酶各2 μL。37℃反應(yīng)4 h后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色、凝膠成像儀觀察分析。運(yùn)用Quantity One軟件進(jìn)行條帶分析，瓊脂糖凝膠上DNA片段按“出現(xiàn)”記為“1”，“不出現(xiàn)”記為“0”，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，SPSS20.0、NTSYS-PC軟件計(jì)算多樣性指數(shù)和相似系數(shù)。

式中，S為物種總數(shù)，Pi為第i種物種個(gè)體數(shù)占群落總個(gè)數(shù)的比例。

式中，n1為抽樣中第1個(gè)菌落的個(gè)數(shù)，n2為抽樣中第2個(gè)菌落的個(gè)數(shù)，n3為抽樣中第3個(gè)菌落的個(gè)數(shù)，依次類(lèi)推，N抽樣中所有物種的個(gè)體總和。

式中，a為某一樣品的酶切圖譜的條帶數(shù)目，b為另一樣品的酶切圖譜 的條帶數(shù)目；j為兩個(gè)泳道所共有條帶的數(shù)目. 完全不同的兩個(gè)圖譜其相似系數(shù)0，而完全相同的2 個(gè)圖譜的相似系數(shù)為1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 鐵皮石斛水提取物對(duì)糖尿病小鼠腸道微生物菌落數(shù)影響

研究發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組小鼠腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)和真菌數(shù)均明顯低于正常對(duì)照組，而乳酸桿菌和雙歧桿菌均明顯高于正常對(duì)照組；鐵皮石斛低劑量組與高劑量組細(xì)菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)和真菌數(shù)均明顯高于模型對(duì)照組，乳酸桿菌數(shù)則明顯低于模型對(duì)照組；鐵皮石斛高劑量組的雙歧桿菌數(shù)明顯低于模型對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而低劑量組僅低于模型對(duì)照組，差別不顯著(P>0.05)。鐵皮石斛高劑量組與低劑量組比較，高劑量組大腸桿菌和細(xì)菌數(shù)均明顯高于低劑量組，高劑量組乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)則明顯低于低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而高低劑量?jī)山M在真菌數(shù)量上比較差異不明顯(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組糖尿病小鼠腸道微生物菌落數(shù)比較

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型對(duì)照組比較，bP<0.05；與鐵皮石斛高劑量組比較，cP<0.05。

2.2 各組小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)與相似性系數(shù)結(jié)果比較

多樣性指數(shù)Shannon和Brillouin反映群落中生物種類(lèi)數(shù)量，其數(shù)值越大說(shuō)明群落的復(fù)雜程度越高.相似性系數(shù)Czekanowski則反映的是群落中生物種類(lèi)對(duì)比度，當(dāng)其數(shù)值升高好，表示對(duì)比后兩個(gè)群落越相似. 經(jīng)SPSS 20.0、NTSYS-PC 軟件軟件分析，各組小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)和相似系數(shù)，正常對(duì)照組和鐵皮石斛高劑量組Shannon指數(shù)和Brillouin指數(shù)均相同，且大于模型對(duì)照組和鐵皮石斛低劑量組相同的兩指數(shù)，說(shuō)明糖尿病小鼠腸道菌群的數(shù)量和種類(lèi)都大幅發(fā)下降，尤其是經(jīng)鐵皮石斛低劑量治療后其數(shù)量和種類(lèi)未得到明顯恢復(fù)，但提高鐵皮石斛劑量則后效果顯著，使得腸道菌群的復(fù)雜程度重新達(dá)到正常組情況。比較各組腸道細(xì)菌群落相似性，鐵皮石斛高劑量組的相似系數(shù)最大，為0.500 0，模型對(duì)照組為0.181 8，鐵皮石斛低劑量組為0.166 7，說(shuō)明鐵皮石斛高劑量組小鼠腸道細(xì)菌群落在細(xì)菌類(lèi)型上與正常組相似度最高，表示高劑量可以較好改善糖尿病小鼠腸道菌群類(lèi)別。見(jiàn)表2。

2.3 鐵皮石斛水提取物對(duì)糖尿病小鼠脂質(zhì)代謝的影響

模型對(duì)照組與正常對(duì)照組在TC上比較無(wú)明顯差異，而TG和LDL-C含量均明顯高于正常對(duì)照組，HDL-C含量則明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)；鐵皮石斛高劑量組與模型對(duì)照比較TC、TG、LDL-C含量明顯降低，而HDL-C明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而低劑量組與模型對(duì)照組比較TC含量明顯降低(P<0.05)，其余指標(biāo)與模型對(duì)照組比較差異不顯著，見(jiàn)表3。

表2 各組小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)與相似性系數(shù)結(jié)果比較

表3 各組小鼠血脂指標(biāo)比較

3 討論

目前西藥治療糖尿病，調(diào)控血糖時(shí)副反應(yīng)發(fā)生率較高。而中醫(yī)在治療方案上考慮患者全身因素，考慮患者發(fā)病后各臟器陰陽(yáng)情況，既能環(huán)境糖尿病患者不適癥狀，降低血糖，又能保護(hù)外周組織，減少并發(fā)癥的發(fā)生[6]。鐵皮石斛是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材， 屬養(yǎng)陰要藥，《中國(guó)藥典》記載其主歸腎經(jīng)，故可治腎陰虛證，是治療腎陰虛型消渴癥的代表藥物[7]。我院通過(guò)研究探討鐵皮石斛水提取物對(duì)糖尿病小鼠腸道微生物及脂類(lèi)代謝的影響。

從表1可以看出模型對(duì)照組小鼠腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)和真菌數(shù)均明顯低于正常對(duì)照組，而乳酸桿菌和雙歧桿菌均明顯高于正常對(duì)照組.這是因?yàn)槿梭w內(nèi)血糖持續(xù)升高，可以改變腸道內(nèi)多種機(jī)會(huì)致病菌的分布和數(shù)量，從而削弱患者腸道抵抗外界環(huán)境變化能力，其抵御病原體的微生物屏障被破壞[8]。因此調(diào)節(jié)患者腸道菌群有利于減少普通降糖藥物的副作用，也提高患者生活質(zhì)量。從我院研究結(jié)果可以看出，鐵皮石斛低劑量組與高劑量組細(xì)菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)和真菌數(shù)均明顯高于模型對(duì)照組，乳酸桿菌數(shù)則明顯低于模型對(duì)照組；鐵皮石斛高劑量組的雙歧桿菌數(shù)明顯低于模型對(duì)照組。而低劑量組僅低于模型對(duì)照組。說(shuō)明通過(guò)治療使得小鼠體內(nèi)腸道菌群數(shù)量不同程度恢復(fù)到正常水平，這與鐵皮石斛含有鐵皮石斛多糖有關(guān)，該多糖在研究過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)無(wú)法被部分細(xì)菌吸收利用，比如金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，從而導(dǎo)致部分細(xì)菌缺少必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而凋亡。但是它可以被乳酸桿菌和雙歧桿菌等益生菌利用吸收，有助于這兩種細(xì)菌的增殖[9-10]。同時(shí)，鐵皮石斛中含有豐富的黏液質(zhì)，可以與胃液一起發(fā)揮協(xié)同作用，幫助修復(fù)腸道中受損的細(xì)胞，有利于乳酸桿菌與腸道細(xì)胞結(jié)合[11]。鐵皮石斛中還含有豐富的微量元素，也是乳酸桿菌必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[12]。鐵皮石斛高劑量組與低劑量組比較，高劑量組大腸桿菌和細(xì)菌數(shù)均明顯高于低劑量組，高劑量組乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)則明顯低于低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而高低劑量?jī)山M在真菌數(shù)量上比較差異不明顯。說(shuō)明提高鐵皮石斛劑量可以增加治療效果，這與Xie SongZi等[13]研究結(jié)果相符合。并且從表2 中可以看出，鐵皮石高劑量組小鼠腸道細(xì)菌群落與正常組最相似，其對(duì)糖尿病小鼠腸道菌群改善最好。

糖尿病患者由于體內(nèi)存在胰島素抵抗，導(dǎo)致組織細(xì)胞能量代謝異常，脂肪和肌肉分解過(guò)快，代謝紊亂，從而加重病情[14-15]。從表3中可以看出，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組在TC上比較無(wú)明顯差異，而TG和LDL—C含量均明顯高于正常對(duì)照組，HDL-C含量則明顯低于正常對(duì)照組。鐵皮石斛高劑量組與模型對(duì)照比較TC、TG、LDL-C含量明顯降低，而HDL-C明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而低劑量組與模型對(duì)照組比較TC含量明顯降低，其余指標(biāo)與模型對(duì)照組比較差異不顯著。說(shuō)明鐵皮石斛在降低血糖同時(shí)，也有助于改善患者體內(nèi)脂質(zhì)代謝，考慮可能與鐵皮石斛有抗炎作用有關(guān)，可以減少動(dòng)脈血管因脂代謝異常造成的炎癥反應(yīng)[16]。

綜上所述，鐵皮石斛水提取物可以有效改善糖尿病小鼠體內(nèi)腸道菌群，提高其免疫力；并使得小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝恢復(fù)平衡，減少動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，尤其是高劑量鐵皮石斛水提取物治療效果更好，下一步可在臨床上進(jìn)一步研究，觀察其對(duì)糖尿病患者的作用是否和小鼠表現(xiàn)相符合。