ADSCs干預(yù)快速擴(kuò)張兔皮膚中α-SMA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

鄭坤坤 胡亞暖 薄其濤 盧俊旭 楊彪炳

[摘要]目的：探究脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）對快速擴(kuò)張皮膚中反應(yīng)攣縮的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)的影響，以及對成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。方法：選取健康新西蘭大白兔腎周脂肪，分離提純ADSCs并培養(yǎng)3代;建立兔擴(kuò)張皮膚模型，在實(shí)驗(yàn)組兔擴(kuò)張皮膚下注射適量ADSCs懸液進(jìn)行干預(yù)，對照組注射了等量的不含血清的DMEM，按照快速擴(kuò)張要求擴(kuò)張;手術(shù)下獲得兩組兔擴(kuò)張后皮膚并固定;制作切片HE染色后統(tǒng)計(jì)皮膚厚度，進(jìn)行免疫組化染色后觀察皮膚中s-SMA陽性率;將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出結(jié)論。結(jié)果：經(jīng)ADSCs干預(yù)的擴(kuò)張兔皮膚與對照組相比，皮膚攣縮率更低，擴(kuò)張皮膚的厚度較對照組厚，α-SMA陽性成纖維細(xì)胞率更低。結(jié)論：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可使擴(kuò)張皮膚增厚，攣縮率降低，降低α-SMA表達(dá)，抑制肌成纖維細(xì)胞形成。ADSCs可協(xié)助提高皮瓣質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞]ADSCs;α-SMA;快速擴(kuò)張術(shù);HE染色;皮膚攣縮率;免疫組化

[中圖分類號(hào)]R329.2? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2019）02-0088-03

Abstract： Objective? ?To investigate the effects of adipose-derived mesenchymal stem cells （ADSCs） on the expression of α-SMA in the contracted skin and the effect of fibroblasts on myofibroblasts. Methods? The peri-renal fat of healthy New Zealand white rabbits was taken， and ADSCs were isolated and purified for 3 generations. The model of rabbit dilated skin was established. The rats in the experimental group were injected with appropriate amount of ADSCs suspension for intervention. The control group was injected with the same amount of serum-free. DMEM was expanded according to the requirement of simple rapid expansion; the skin of the two groups of rabbits was obtained and fixed under surgery; the skin thickness was counted after HE staining， and the positive rate of s-SMA in the skin was observed after immunohistochemical staining; The analysis concludes. Results? Compared with the control group， the expanded rabbit skin treated with ADSCs had a lower skin contracture rate. The thickness of the expanded skin was thicker than that of the control group， and the rate of α-SMA positive fibroblasts was lower. Conclusion? ?Adipose-derived mesenchymal stem cells can thicken the skin， reduce the contracture rate， decrease the expression of α-smooth muscle actin and inhibit the formation of myofibroblasts. ADSCs can help improve the quality of the flap.

Key words： ADSCs; α-SMA; skin soft tissue expansion; HE staining; skin contraction rate; immunohistochemistry

由于人體皮膚組織是有限的，當(dāng)人體某一處或多處的皮膚因先天性因素或后天的損傷造成皮膚缺損的程度超過了其自行愈合能力時(shí)，即使經(jīng)過了積極的內(nèi)外科治療也會(huì)留下大片皮膚瘢痕或者缺損，為患者的日常生活帶來嚴(yán)重不便，甚至影響患者心理，帶來心理上的自卑等。皮膚軟組織的快速擴(kuò)張技術(shù)是通過在皮膚下埋入擴(kuò)張器，連續(xù)或簡短的注水增加對擴(kuò)張器以外皮膚的壓力來獲取額外皮瓣的技術(shù)。ADSCs具有多向分化潛力[1-4]，其來源相當(dāng)充足且增殖速度也很快，獲取脂肪組織時(shí)對機(jī)體的創(chuàng)傷性較小，ADSCs的多向分化能力也不會(huì)伴隨機(jī)體年齡的增大而下降。在本課題組的前提研究中發(fā)現(xiàn)ADSCs的局部移植能夠促進(jìn)新生皮膚組織的再生，提高擴(kuò)張皮膚質(zhì)量，減少皮膚組織擴(kuò)張速率，縮短擴(kuò)張時(shí)間[5-7]。因此，ADSCs的局部注射確實(shí)能夠降低擴(kuò)張皮膚的攣縮率，本實(shí)驗(yàn)將對ADSCs降低擴(kuò)張皮膚攣縮率做進(jìn)一步研究。在病理改變中，成纖維細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)換為肌成纖維細(xì)胞，特征性表達(dá)α-SMA，產(chǎn)生收縮力[8]。并且擴(kuò)張的速度越快，α-SMA陽性表達(dá)率也會(huì)越高，皮瓣發(fā)生攣縮越加嚴(yán)重[9]。本研究在前提研究的基礎(chǔ)上，通過擴(kuò)張皮膚局部注射同源ADSCs，探究ADSCs對擴(kuò)張皮膚中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)的影響，為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是否有效降低擴(kuò)張皮膚攣縮率提高擴(kuò)張皮膚質(zhì)量提供更加充分的基礎(chǔ)依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：實(shí)驗(yàn)對象為新西蘭白兔20只（體健、月齡約3個(gè)月，重2.5kg左右;批號(hào)：scxk（魯）20160002，采購于濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心）。亂數(shù)表法隨機(jī)分為兩組，每組10只，其中實(shí)驗(yàn)組給予ADSCs處理，對照組給予無血清DMEM處理。

1.2 兔ADSCs的提取、培養(yǎng)及鑒定：成功麻醉后，將兔子以仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)操作臺(tái)上，備皮消毒后，手術(shù)刀切開兔腹股溝區(qū)表層皮膚組織，逐層分開腹股溝取深部組織，取腎周脂肪組織。將取得的脂肪組織分離、提純、培養(yǎng)和傳代，用第3代ADSC通過鏡下觀察表面標(biāo)志物鑒定和多向分化能力鑒定證實(shí)為ADSCs，備用。

1.3 兔皮膚快速擴(kuò)張模型的建立：將完成分組的20只大白兔分別進(jìn)行手術(shù)，用美藍(lán)標(biāo)記出大白兔脊柱左側(cè)的大小為2cm×2cm的正方形區(qū)域作為埋入擴(kuò)張器的部位，備皮消毒后，于標(biāo)記區(qū)域的上邊界做一垂直于脊柱約2cm的切口，鈍性分離皮下組織到淺筋膜的深層至能容納擴(kuò)張器。將完整的50ml圓形硅橡膠軟組織皮膚擴(kuò)張器埋入皮下腔隙中，排盡皮膚與擴(kuò)張囊間的空氣后嚴(yán)密地縫合切口。肌注抗生素以防感染，1周后拆除縫線。擴(kuò)張器埋入1周后進(jìn)行第1次注水?dāng)U張，實(shí)驗(yàn)組采用已經(jīng)制備好的ADSCs懸液1ml擴(kuò)張皮下局部注射，而對照組局部擴(kuò)張皮膚下則注入等量的無血清DMEM溶液以作對照，1h后進(jìn)行注水?dāng)U張（注水時(shí)維持囊內(nèi)壓力在40mmHg）。重復(fù)以上注水?dāng)U張過程，每48h注水1次，8次完成擴(kuò)張。

1.4 兔擴(kuò)張皮膚標(biāo)本采集及石蠟切片制作：測量兔擴(kuò)張后皮膚面積并記錄數(shù)值。對兔皮膚擴(kuò)張?zhí)幊Ｒ?guī)消毒鋪巾，切去擴(kuò)張皮膚，靜置5min后記錄擴(kuò)張皮膚攣縮后面積。算出每個(gè)皮瓣的攣縮率[10]，固定保存后制成石蠟切片備用。

1.5 檢測皮膚厚度及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)：對來自兩組的每個(gè)實(shí)驗(yàn)對象皮瓣標(biāo)本所制成的切片隨機(jī)選取2張，分為兩組（每組每個(gè)實(shí)驗(yàn)對象皮瓣切片1張，共20張），一組進(jìn)行HE染色，鏡下測量表皮層的厚度;另一組進(jìn)行α-SMA免疫組化染色，將每一張切片在放大了400倍的顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)真皮層的觀察視野，總共60個(gè)視野，記錄每一個(gè)視野中的成纖維細(xì)胞數(shù)，根據(jù)胞漿中有無DAB染色的棕色顆粒區(qū)分陽性和陰性的細(xì)胞，計(jì)數(shù)呈陽性的細(xì)胞個(gè)數(shù)和總數(shù)目，兩者比值為陽性細(xì)胞率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，本實(shí)驗(yàn)主要采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x?±s）表示，設(shè)置置信值在95%，當(dāng)P<0.05結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)意義。

2? 結(jié)果

2.1 ADSCs降低攣縮率：實(shí)驗(yàn)組和對照組的擴(kuò)張皮膚自兔背部取下后均產(chǎn)生了不同程度的攣縮，據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組的收縮率明顯小于對照組。見表1。

2.2 ADSCs干預(yù)可增加擴(kuò)張皮膚表皮層厚度：經(jīng)HE染色的擴(kuò)張皮膚切片鏡下可見實(shí)驗(yàn)組的表皮層厚度明顯高于對照組，總厚度也增加。見表2～3。

2.3 ADSCs干預(yù)使快速擴(kuò)張皮膚的α-SMA表達(dá)減少：各組擴(kuò)張皮膚組織切片經(jīng)免疫組化染色后鏡檢可見目標(biāo)蛋白被染為棕色顆粒，棕色顆粒的濃度實(shí)驗(yàn)組少于對照組。實(shí)驗(yàn)組α-SMA陽性成纖維細(xì)胞率與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

3? 討論

ADSCs是一種體積小、分化低的多功能干細(xì)胞。由于可以分離出ADSCs的脂肪組織十分豐富，獲取脂肪組織比較容易且對機(jī)體的損害小，獲取時(shí)也不會(huì)涉及到倫理方面的問題，還可以將自體的脂肪組織直接進(jìn)行移植等優(yōu)點(diǎn)，吸引了科研工作者們的目光。

皮膚軟組織擴(kuò)張技術(shù)指通過間斷性性或非間斷性增大皮下擴(kuò)張器的體積，使擴(kuò)張器對其表面被覆的皮膚產(chǎn)生的張力逐漸增大，從而擴(kuò)大擴(kuò)張器表面被覆的皮瓣面積產(chǎn)生額外皮膚的技術(shù)。廣泛應(yīng)用于替代修復(fù)鄰近的瘢痕或其它的皮膚缺損和畸形等。為創(chuàng)傷性瘢痕、燒傷先天性及后天性缺損等的修復(fù)重建帶來了新的方法，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)皮瓣移植“拆東墻補(bǔ)西墻”的不足，不僅在整形外科得到了廣泛的應(yīng)用，也將會(huì)成為整個(gè)外科學(xué)里程碑式的進(jìn)展。皮膚軟組織快速擴(kuò)張術(shù)的提出縮短了擴(kuò)張周期，但有研究發(fā)現(xiàn)快速擴(kuò)張所得到的皮瓣攣縮率大于常規(guī)擴(kuò)張所得到的皮瓣[11]。本實(shí)驗(yàn)采用了快速擴(kuò)張術(shù)制備動(dòng)物模型，皮膚的快速擴(kuò)張雖然縮短了擴(kuò)張周期，但是對所得的皮瓣損傷較大，攣縮率較常規(guī)擴(kuò)張術(shù)有所增加。

α-SMA即α-平滑肌肌動(dòng)蛋白，原存在于肌細(xì)胞當(dāng)中，是肌細(xì)胞收縮的主要?jiǎng)恿碓?，成纖維細(xì)胞因許多的病理性刺激產(chǎn)生具有收縮力的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，或者轉(zhuǎn)化為能收縮的肌成纖維細(xì)胞，可特異性的表達(dá)α-SMA[8，12]本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了α-SMA特異性，通過免疫組化染色擴(kuò)張皮膚中的α-SMA，間接反應(yīng)肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量。因這種收縮力可導(dǎo)致皮瓣攣縮，所以α-SMA也對攣縮率具有一定的體現(xiàn)作用，并成正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過測定α-SMA間接反映擴(kuò)張皮瓣的攣縮情況。擴(kuò)張刺激也屬于病理性刺激，而通過快速擴(kuò)張法所得的皮瓣中α-SMA的表達(dá)情況明顯高于用常規(guī)方法取得的皮瓣，這可能是擴(kuò)張速度越快皮瓣攣縮越嚴(yán)重[13]。因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用快速擴(kuò)張的方法制備兔皮膚擴(kuò)張的模型，以研究ADSCs是否通過影響快速擴(kuò)張皮膚模型中肌成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生，從而為ADSCs能夠降低擴(kuò)張皮膚攣縮率提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)組（ADSCs組）中α-SMA的陽性表達(dá)率低于對照組。張琪等[13]的研究中，在瘢痕內(nèi)注射ADSCs可以降低α-SMA而改善瘢痕中膠原纖維堆積并改善瘢痕增生。王喜燕等[9]的研究表明快速擴(kuò)張法所得的皮瓣中α-SMA陽性表達(dá)明顯高于通過常規(guī)擴(kuò)張方法所得到的皮瓣，因此他們認(rèn)為α-SMA的增多可能是快速擴(kuò)張加重?cái)伩s所致。在本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果中ADSCs的干預(yù)使快速擴(kuò)張法得到的皮瓣中α-SMA的表達(dá)降低，因此可推斷ADSCs的介入可以抑制成纖維母細(xì)胞病理性地轉(zhuǎn)變成肌纖維母細(xì)胞。有研究表明ADSCs分泌的HGF能夠抑制肌成纖維細(xì)胞的生成[14-16]，為ADSCs降低擴(kuò)張皮膚攣縮率提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

綜上所述，ADSCs在快速擴(kuò)張術(shù)中的應(yīng)用不僅縮短了擴(kuò)張周期，降低了長期攜帶擴(kuò)張器對患者帶來的心理影響，而且對臨床上如何提高擴(kuò)張皮膚的質(zhì)量開辟了一條新的途徑。

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