HPLC法測定頭孢氨芐原料及膠囊中的有關物質

鐘瑩 陳紅英 王健松

(廣州白云山醫(yī)藥集團股份有限公司白云山制藥總廠，廣州 510515)

頭孢氨芐為β-內(nèi)酰胺類抗生素，耐酸，口服吸收良好[1]。臨床上用于敏感菌所致的急性扁桃體炎、咽頰炎、中耳炎、鼻竇炎、支氣管炎、肺炎等呼吸道感染、尿路感染及皮膚軟組織感染等，其在生產(chǎn)過程中可能存在α-苯甘氨酸(雜質A)、7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸(雜質B)和Δ-2-頭孢氨芐(雜質F)等[2]雜質。2015年版中國藥典中該品種原料和膠囊有關物質測定方法采用高效液相色譜法[3]，但發(fā)現(xiàn)使用該法頭孢氨芐與其同分異構體Δ-2-頭孢氨芐難達到有效分離，并且流動相中磷酸二氫鉀溶液的濃度較高。本文對方法進行了研究和改進，可使各雜質峰得到有效分離和檢出，更好保障產(chǎn)品質量。

1 儀器與試藥

1200高效液相色譜儀(DAD檢測器，Agilent公司)，1260高效液相色譜儀(DAD檢測器，Agilent公司)，CPA225D十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)。

頭孢氨芐(廠家A，批號：00167)，頭孢氨芐膠囊(廠家B，規(guī)格0.125g，批號：2170501、2170601、2170602)，頭孢氨芐對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：130408-201410，89.0%)，雜質對照品：雜質A(α-苯甘氨酸，中國食品藥品檢定研究院，批號：130415-200904，98.5%)。雜質B(7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸，中國食品藥品檢定研究院，批號：130416-201006，94.4%)，雜質F(Δ-2-頭孢氨芐，TRC，批號：6-RNP-168-2，95%)，甲醇(色譜純，美國Merk公司)，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

2.1.1 色譜條件

色譜柱Thermo Hypersil GOLD，C18(4.6mm×100mm, 3μm)；流動相：流動相A為0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液(用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5.0)，流動相B為甲醇，梯度洗脫(0～20min，A：95%→55%；20～37min，A：55%→95%；37～40min，A保持95%)；檢測波長220nm；流速為1mL/min；進樣量20μL。

2.1.2 系統(tǒng)適用性

取頭孢氨芐，雜質A、B和F對照品適量加pH7.0磷酸鹽緩沖液適量超聲使溶解，加流動相A稀釋制成各含10μg/mL的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。記錄色譜圖，見圖1，頭孢氨芐峰理論塔板數(shù)為55968，雜質A與雜質B的分離度為1.8，頭孢氨芐與雜質F的分離度為10.4。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液

取雜質A、雜質B和雜質F對照品各約10mg，精密稱定，置于同一100mL量瓶中，加pH7.0磷酸鹽緩沖液約20mL超聲使溶解，再用流動相A稀釋至刻度，搖勻，精密量取2mL，置于20mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為雜質對照品溶液。

圖1 系統(tǒng)適用性HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of system suitability

2.2.2 供試品溶液

分別取樣品適量，精密稱定，用流動相A溶解并稀釋制成含頭孢氨芐1.0mg/mL的溶液，作為供試品溶液。

2.2.3 自身對照溶液

精密量取供試品溶液1mL，置于100mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.3 測定法

精密量取供試品溶液、對照溶液與雜質對照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，雜質A、B和F按外標法以峰面積計算；其他單個雜質按自身對照法計算(圖2)。

圖2 供試品溶液的HPLC色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram of sample

2.4 與中國藥典2015年版方法比較

2.4.1 色譜條件

采用歐洲藥典和中國藥典方法，結果頭孢氨芐和雜質F分離度分別為0.87和1.15，均未達到基本分離(圖3)。為提高頭孢氨芐和雜質F的分離度，流動相組成選擇濃度低的鹽溶劑(0.05mol/L pH5.0磷酸二氫鈉溶液-甲醇)，選用粒徑小的色譜柱，并優(yōu)化了流動相梯度洗脫條件。結果各峰分離效果好，分析時間合適(圖1)。

2.4.2 系統(tǒng)適用性試驗

中國藥典系統(tǒng)適用性要求為：供試品溶液80℃破壞60min后，頭孢氨芐與相鄰峰分離度應大于1.5。但破壞程度超過20%，產(chǎn)生的雜質峰較多，采用中國藥典2015年版色譜條件，頭孢氨芐與前后相鄰雜質峰的分離度為3.04和1.66，但其他降解雜質峰之間分離度較差(圖4)。采用優(yōu)化后方法，頭孢氨芐與前后相鄰雜質峰的分離度為2.55和2.09，其他降解雜質峰之間分離度良好，說明方法可使降解雜質峰得到有效分離和檢出(圖5)。因破壞條件過于劇烈，系統(tǒng)適用性試驗改為考察雜質A和B，頭孢氨芐和雜質F的分離度更為合理，具體見“2.1.2”項。

2.4.3 樣品測定

分別采用本實驗方法和中國藥典2015年版方法，對原料、膠囊以及在25℃/75%相對濕度(RH)條件下放置10d的原料進行對比檢測，結果見表1～2。結果本實驗方法能有效檢出雜質F，且檢出的雜質個數(shù)更多，見圖6～7，有助于發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中的質量問題，促使產(chǎn)品質量的提高。

圖3 雜質F和頭孢氨芐HPLC色譜圖Fig. 3 HPLC chromatograms of impurity F and cephalexin

圖4 供試品溶液80℃破壞60min HPLC色譜圖Fig. 4 HPLC chromatogram of sample placed under 80℃ for 60min

圖5 供試品溶液80℃破壞60min HPLC色譜圖—優(yōu)化后方法Fig. 5 HPLC chromatogram of sample placed under 80℃ for 60min—optimized method

3 方法學驗證

3.1 專屬性

3.1.1 空白干擾試驗

稱取空白輔料(相當于0.125g規(guī)格一粒的量)置100mL量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取20μL注入液相色譜儀，結果空白輔料無干擾。

3.1.2 強制破壞性試驗(表3)

取原料及膠囊分別用1mol/L鹽酸溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液、3%過氧化氫和高溫60℃、光照等苛刻條件進行破壞試驗后，按上述色譜條件進行檢測。

結果表明空白溶劑對測定無干擾，在各種破壞條件下所得的降解產(chǎn)物峰與主成分峰分離良好，降解產(chǎn)物峰之間也具有良好的分離度，各條件下主峰純度因子均大于990。通過比較試驗前后總峰面積的變化，物料平衡(A破壞后總峰面積/A破壞前總峰面積×100%)在90%～110%，方法具有專屬性。雜質A和雜質B在各條件下均較穩(wěn)定，雜質F在堿性條件下稍增加。

3.2 其他驗證項目

對本實驗方法的定量限、檢測限、準確度、重復性和溶液穩(wěn)定性等進行了研究，見表4，結果方法的靈敏度、精密度和準確度等都較好，方法科學、合理、可行，適用于頭孢氨芐原料及膠囊有關物質檢測。

4 討論

中國藥典2015年版頭孢氨芐原料及膠囊有關物質測定方法中流動相組成為0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH5.0)-甲醇，在此條件下頭孢氨芐與雜質F分離度為1.15，未能達到基本分離，且流動相中磷酸二氫鈉的濃度較高，易析出晶體，阻塞色譜柱，系統(tǒng)適用性試驗對供試品溶液破壞程度過于劇烈。本法參考歐洲藥典9.4[2]頭孢氨芐原料有關物質測定方法，降低磷酸二氫鈉溶液的濃度，篩選了合適的色譜柱，并優(yōu)化了梯度洗脫條件，不但主峰及雜質峰出峰時間適宜，并能有效地分離各個雜質峰。經(jīng)破壞后的降解產(chǎn)物在此色譜條件下也能有效地與主峰完全分離，具良好的專屬性。

雜質A和雜質B穩(wěn)定，在強制降解試驗和穩(wěn)定性中均未見增長。雜質F為頭孢氨芐的同分異構體，在堿性條件下稍增加，在穩(wěn)定性放置過程中會增加。方法中以雜質對照品外標法檢測這3個特定雜質的量，能較好地分析各雜質在穩(wěn)定性放置過程中的變化趨勢，有助于發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中的質量問題，促使產(chǎn)品質量的提高。

采用本方法分別對頭孢氨芐原料及膠囊進行有關物質檢測，方法的適用性良好，并將結果與中國藥典2015年版測定結果比較，具有更強的分析雜質的能力。本方法簡單、靈敏，適用于頭孢氨芐原料及膠囊有關物質的檢測。

表1 頭孢氨芐及膠囊有關物質測定結果—2015年版中國藥典方法Tab. 1 The determination results of the related substances of samples—ChP 2015

圖6 25℃/75%RH放置10d樣品HPLC色譜圖Fig. 6 HPLC chromatogram of sample placed under 25℃/75%RH for 10d

表2 頭孢氨芐及膠囊有關物質測定結果—優(yōu)化后方法Tab. 2 The determination results of the related substances of samples—optimized method

表3 強制破壞性試驗測定結果Tab. 3 The determination results of the destructive tests

表4 其他驗證項目測定結果Tab. 4 The determination results of other verification items

圖7 25℃/75%RH放置10d樣品HPLC色譜圖Fig. 7 HPLC chromatogram of sample placed under 25℃/75%RH for 10d