王欣榮 張雪霞 褚以文 鄭智慧 茍小軍 路新華 王勇軍
(1 抗生素研究與再評價四川省重點實驗室,四川抗菌素工業(yè)研究所,成都 610052;2 華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司,石家莊 050015)
菌渣是產(chǎn)生于微生物藥物提取過程中的工業(yè)廢棄物,主要含有已滅活的菌絲體、殘余培養(yǎng)基、微生物代謝產(chǎn)物、部分殘留效價,以及提取時加入的絮凝劑、助濾劑等成分。微生物素發(fā)酵產(chǎn)生的菌渣中抗菌素殘留較高,如頭孢菌素C在菌渣中的殘留約2~2.5mg/g,青霉素在菌渣中的殘留約1~2mg/g,紅霉素在菌渣中的殘留約0.2~0.9mg/g,環(huán)孢菌素在菌渣中的殘留約0.5~2mg/g,環(huán)孢菌素在菌渣中的殘留約0.1~0.4mg/g,這些殘留物最終都會進(jìn)入環(huán)境中,日積月累可能會導(dǎo)致微生物逐漸產(chǎn)生耐藥性和其它未知的環(huán)境風(fēng)險,2008年被列入《國家危險廢物目錄》[1]?,F(xiàn)有菌渣無害化減量化處置技術(shù)如焚燒、填理以及制造肥料和飼料等普遍存在成本高、二次污染、殘留藥物積累等負(fù)面效應(yīng)和隱患[2]。我國已經(jīng)成為全球最大的抗生素原料藥生產(chǎn)國和出口國,原料藥產(chǎn)量已占全球總產(chǎn)量80%,其中出口占到全世界原料藥市場的70%以上。2012年全國抗生素產(chǎn)量約14萬噸,相應(yīng)產(chǎn)生菌渣超過150萬噸,因此探討菌渣無害化、減量化處理顯得尤為重要[3]。
本研究以環(huán)孢菌素菌渣作為處理對象,研究采用多種嗜熱微生物進(jìn)行無害化、減量化處理,實現(xiàn)環(huán)孢菌素生產(chǎn)過程中的菌渣減量排放和基本去除環(huán)孢菌素殘留。
1.1.1 菌種
嗜熱微生物1#:厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus mongoliensisSIIA-1501a)、嗜熱微生物2#:土芽孢桿菌(Geobacillussp. SIIA-1501g)和極端嗜熱菌3#:Calditerricola yamamuraeSIIA-1501c,本研究組保藏。
1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
LB平板及斜面培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物8,氯化鈉8,瓊脂16,pH自然。
極端嗜熱菌YPG改性平板及斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖8,蛋白胨10,酵母膏12,磷酸氫二鉀2,自來水配制,pH7.2~7.4。
LB種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖8,蛋白胨10,酵母膏12,氯化鈉8,自來水配制,pH6.8~7.0。
極端嗜熱菌種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖8,蛋白胨10,酵母膏12,氯化鈉8,磷酸氫二鉀2,自來水配制,pH6.8~7.0。
LB發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖8,蛋白胨10,酵母膏12,氯化鈉8,自來水配制,pH6.8~7.0。
極端嗜熱菌發(fā)酵培養(yǎng)(g/L):葡萄糖8,蛋白胨10,酵母膏12,氯化鈉8,磷酸氫二鉀2,自來水配制,pH6.8~7.0。
1.1.3 試劑與儀器
試劑:試劑均為國產(chǎn)分析純,環(huán)孢菌素對照品購自美國藥典委員會。
儀器:立式蒸氣壓滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;Agilent technologies1200高效液相色譜儀;搖床(美國NBS);發(fā)酵槽,200L微生物發(fā)酵罐系統(tǒng)(華北制藥工程裝備有限公司)。
1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)方法
培養(yǎng)溫度:厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus mongoliensisSIIA-1501a),培養(yǎng)溫度55℃,培養(yǎng)基為LB;嗜熱土芽孢桿菌(Geobacillussp. SIIA-1501g),培養(yǎng)溫度65~70℃,培養(yǎng)基為LB;極端嗜熱菌(Calditerricola yamamuraeSIIA-1501c),培養(yǎng)溫度75℃。
斜面及平板培養(yǎng)方法:無菌環(huán)取菌種涂布于培養(yǎng)基上,培養(yǎng)3~5d。
搖瓶種子培養(yǎng):分別從各菌株斜面上刮菌苔接種于種子培養(yǎng)基中,培養(yǎng)1~2d,搖床轉(zhuǎn)速220r/min。待各菌液A600>1.5,并瓶。并瓶后的種子液接種于發(fā)酵罐。
發(fā)酵罐培養(yǎng):200L發(fā)酵罐內(nèi)裝150L發(fā)酵培養(yǎng)基,接種量0.1%~0.5%(V/V),發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速100~200r/min,通氣量1:0.1~0.3,A600>1.5終止培養(yǎng)。菌劑成品發(fā)酵液直接分裝10kg/桶。
1.2.2 菌渣的堆肥處理
試驗組:取環(huán)孢菌素菌渣,加自來水調(diào)成含水量50%~65%,加入0.1%菌劑(W/W),用鏟車翻拌均勻,通氣量:0.1vvm。每隔3h測量1次堆心溫度,溫度超過對應(yīng)嗜熱菌的上限翻拋一次物料。當(dāng)一個處理階段后期溫度不再升高后,加入下一種菌劑(先加厭氧芽孢桿菌:菌劑A,然后是嗜熱地芽孢桿菌:菌劑B,最后加入極端嗜熱菌:菌劑C)。其中厭氧芽孢桿菌處理時溫度不能超過65℃,嗜熱地芽孢桿菌不超過80℃,而極端嗜熱菌不超過105℃。
空白對照組:取環(huán)孢菌素菌渣,加自來水調(diào)成含水量50%~65%,用鏟車翻拌均勻,通氣量:0.1vvm。每隔3h測量1次堆心溫度。
1.2.3 環(huán)孢菌素效價分析方法[4]
高效液相色譜系統(tǒng)為Agilent1200,色譜柱為C18反相柱(250mm×4.6mm, 5μm);流動相為乙腈:水=80:20;柱溫70℃;檢測波長210nm;流速1.5mL/min;進(jìn)樣量20μL。
1.2.4 碳氮磷鉀分析[5]
按照有機肥料標(biāo)準(zhǔn)NY525-2012測定全碳、全磷、全鉀和全氮的含量。
堆肥過程中的溫度變化是堆體內(nèi)微生物活性變化的重要反應(yīng)。堆體中的水分不僅可以作為微生物代謝和生理活動所需營養(yǎng)物質(zhì)的載體,還可以蒸發(fā)帶走熱量,調(diào)節(jié)堆體溫度。微生物在生長繁殖過程中分解和利用殘存蛋白質(zhì)、糖、氨基酸、無機鹽和其它有機物時放出熱量使堆體溫度升高含水量減少,堆體重量減少,環(huán)孢菌素殘留減少??瞻讓φ战M具體指標(biāo)見表1,試驗組見表2。
從表1可知,處理過程中,由于只有環(huán)境微生物作用,生產(chǎn)過程漫長,堆心最高溫度為62.6℃。菌渣經(jīng)過45d自然堆肥,環(huán)孢菌素菌渣減量40%以上,廢渣中環(huán)孢菌素殘留為300mg/L以上。
從表2可知,環(huán)孢菌素菌渣經(jīng)過厭氧芽孢桿菌堆肥處理,第2天溫度達(dá)到接近50℃,第7天溫度開始降低,說明該菌生長代謝開始減速。第8天接種嗜熱地芽孢桿菌,堆體迅速升溫,到第13天生長代謝開始減速。第14天接種極端嗜熱菌,堆心溫度最高到達(dá)105.6℃。在整個過程中,從第2天起,菌渣中的主要菌群已變?yōu)榻臃N菌株,優(yōu)勢菌群依次為:1#、 2#和3#,表明菌渣的減量變化因這3種菌的活動引起的。
表1 試驗組堆肥過程各指標(biāo)變化情況Tab. 1 The course of batch culture (n=5)
表2 試驗組堆肥過程各指標(biāo)變化情況Tab. 2 The course of batch culture (n=5)
經(jīng)過3周的新工藝處理,環(huán)孢菌素菌渣減量80%以上,廢渣中環(huán)孢菌素殘留去除率近99%。經(jīng)過處理的菌渣,環(huán)孢菌素A的殘留低于10mg/L,進(jìn)入環(huán)境后,環(huán)孢菌素A的殘留遠(yuǎn)低于其作用微生物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)(256~512mg/L)[8],已較難以引起耐藥性的產(chǎn)生,且環(huán)孢菌素A通常情況不作為抗生素使用,因而已不具有環(huán)境危害性。
堆肥產(chǎn)熱本質(zhì)上是微生物新陳代謝的過程,有機物在此過程中被不斷分解,并以NH3、H2O、CO2等形式揮發(fā)損失,造成氮元素和碳元素絕對量及總干物質(zhì)質(zhì)量逐漸減少,并且碳的消耗速率快于氮源的消耗,堆肥結(jié)束時,物料中的磷鉀等養(yǎng)分相對含量高于原始物料,含水率逐步下降[6]。在本試驗中引入了超高溫菌,大部分氮源也被水解以NH3的形式揮發(fā),因此在整個處理過程中,物料的C/N呈現(xiàn)一個先下降后回升的過程,見圖1。這是因為中溫菌菌消耗有機物,使碳源消耗以二氧化碳的形式釋放,物料的C/N下降;后期菌渣在超高溫菌的作用下,菌渣溫度進(jìn)一步升高,使得NH3揮發(fā),物料的C/N下降。最后的剩余的物料絕大部分碳源和氮源被消耗,殘留物主要為磷鉀等成分。
圖1 堆肥過程中C/N的變化Fig. 1 The change of C/N in the composting process
環(huán)孢菌素菌渣依次經(jīng)過厭氧芽孢桿菌堆肥處理5~8d,嗜熱地芽孢桿菌堆肥處理4~7d和極端嗜熱菌堆肥處理4~6d,環(huán)孢菌素菌渣減量80%以上,廢渣中環(huán)孢菌素殘留去除率近99%。常用的堆肥處理菌渣方式是多菌混合處理,弊端在于每種菌體需要的生長溫度不一樣,而且存在相互抑制的現(xiàn)象,并且周期達(dá)到40d,藥物殘留高。本工藝分階段補入不同細(xì)菌,生長溫度逐步提高,每種菌都能夠最大限度發(fā)揮其生理功能,前一步菌體死亡后又成為下一步菌的營養(yǎng)。最后加入超高溫嗜熱菌(Calditerricola yamamurae)使得堆肥溫度達(dá)到100℃以上,消耗有機質(zhì)的同時又使絕大部分NH3得以釋放。由于雷帕霉素、他克莫司、霉酚酸和咪唑立賓等菌渣性質(zhì)與環(huán)孢菌素A菌渣類似,可以研究將本工藝用于這些菌渣的無害化和減量化處理。
在早期,抗生素菌渣一直被作為工業(yè)廢棄物而丟棄。為了有效利用抗生素菌渣,從20世紀(jì)50年代以來,抗生素菌渣被廣泛用作動物蛋白飼料和飼料藥用添加劑。但是其中殘留的抗生素會在動物體內(nèi)富集,并通過泌乳、產(chǎn)蛋而進(jìn)入奶、蛋中,進(jìn)而對人類產(chǎn)生毒、副作用,使人體內(nèi)的致病菌產(chǎn)生抗藥性。2002年2月,農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布176號公告,禁止抗生素菌渣在飼料和動物飲用水中使用[7],大部分抗生素生產(chǎn)廠無力處理生產(chǎn)過程產(chǎn)生的大量菌渣,以每噸數(shù)千元的代價交由第三方處理。采用三聯(lián)菌處理環(huán)孢菌素菌渣,實現(xiàn)了無害化和減量化,廢渣中環(huán)孢菌素殘留基本去除,經(jīng)處理后的殘渣含有豐富的磷鉀等成分,且沒有其它危險廢物特性,可進(jìn)一步探討用于生產(chǎn)有機肥,具備較好的環(huán)境效益和社會效益。