淋球菌對大觀霉素耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

孫思 劉蘭蘭 佟立峰 呂純芳 羅珍胄,* 陳紹椿 陳祥生

(1 深圳市南山區(qū)慢性病防治院，深圳 518000；2 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，南京 210042)

淋球菌(Neisseria gonorrhoeae, NG)是全球最常見的性病病原體之一，由其所致的淋病在全球范圍內(nèi)流行。淋病能導(dǎo)致泌尿生殖系統(tǒng)化膿性臨床表現(xiàn)，如果未及時治療，將可能向組織入侵，導(dǎo)致睪丸炎、附睪炎、骨盆炎癥或輸卵管炎，造成女性不孕、異位妊娠、胎膜早破和男性不育等后遺癥；若全身性擴(kuò)散，將導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎或皮炎等。除此之外，淋病還將加大艾滋病毒感染風(fēng)險[1]。

淋病的治療藥物是抗生素，但由于抗生素的濫用，加大了淋球菌對抗生素的選擇壓力，同時淋球菌之間易發(fā)生耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，由此導(dǎo)致淋球菌先后對磺胺類抗生素、青霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星和氧氟沙星普遍耐藥，同時也對目前推薦治療藥物(頭孢曲松、頭孢克肟、大觀霉素)表現(xiàn)出敏感性下降的趨勢[1]。大觀霉素作為多數(shù)國家治療淋病的推薦藥物之一，在控制淋病的流行、預(yù)防淋病的后遺癥以及降低艾滋病感染風(fēng)險等方面起到重要作用，但部分國家和地區(qū)已有報道對大觀霉素耐藥的淋球菌菌株。因此，研究淋球菌對大觀霉素的耐藥機(jī)制刻不容緩。

本文將從淋病的流行現(xiàn)狀、淋球菌的耐藥現(xiàn)狀、大觀霉素在目前淋病治療方案中的作用、淋球菌對大觀霉素耐藥機(jī)制等方面進(jìn)行綜述。

1 淋病的流行現(xiàn)狀和淋球菌的耐藥現(xiàn)狀

1.1 淋病的流行現(xiàn)狀

2012年，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)估計全世界每年有7800萬人感染淋病，其中西太平洋區(qū)域3520萬人、東南亞區(qū)域1140萬人、非洲區(qū)域1140萬人。另外，在醫(yī)療資源缺乏的區(qū)域，由于檢測手段的缺乏，病例報告的不完整，可能使其報告的病例數(shù)遠(yuǎn)低于真實(shí)情況[2]。

淋病在美國是第二大常見性病，2017年美國報告病例數(shù)約為55.56萬，發(fā)病率為171.9/10萬，其中南部地區(qū)發(fā)病率最高，為194.0/10萬[3]。2017年，英國新發(fā)淋病患者數(shù)目超過44500例，并且大部分病患的年齡低于25歲[4]。韓國衛(wèi)生和福利部估計韓國淋病的年發(fā)病率為100/10萬[5]。

在我國，1953年淋病早期患者已近絕跡，1960年基本上完成了晚期患者的普查普治，1964年已基本消失淋病[6]。但我國在1991—1999年淋病的發(fā)病率逐漸上升至最高峰，達(dá)到22.78/10萬，之后經(jīng)過一系列有效的防治措施，淋病的發(fā)病率在1999—2006年總體呈現(xiàn)下降趨勢，只是在2004年出現(xiàn)一個小的發(fā)病高峰(17.34/10萬)[6]，發(fā)病率目前最低的年份是2012年(6.78/10萬)，近幾年的發(fā)病率變化不大。目前淋病的上報例數(shù)居于性病中的第二位，全國甲乙類法定傳染病報告發(fā)病數(shù)的第5位，2016年的上報例數(shù)是115024，發(fā)病率為8.36/10萬，2017年上報例數(shù)為138855，發(fā)病率為10.06/10萬[7]。

1.2 淋球菌的耐藥現(xiàn)狀

淋病在各國受到重視，不僅在于其發(fā)患者數(shù)之多，更在于淋球菌對治療藥物的耐藥性。迄今為止，淋球菌已先后對推薦用于治療淋病的抗生素(磺胺類抗生素、青霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星)產(chǎn)生廣泛耐藥[1]。

其他各國(或地區(qū))淋球菌耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示淋球菌對青霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星的耐藥率非常之高，對阿奇霉素也表現(xiàn)出一定的耐藥性，同時對頭孢類抗生素、大觀霉素的敏感性近年來都有所下降。對PubMed近10年的文獻(xiàn)統(tǒng)計，其他各國(或地區(qū))淋球菌對青霉素耐藥率范圍為0.8%～100%[5,8]，四環(huán)素耐藥率范圍為6%～100%[9-10]，環(huán)丙沙星耐藥率范圍為2%～100%[9-10]，阿奇霉素耐藥率范圍為0.17%～25%[11-12]，大觀霉素耐藥率范圍為0.6%～11.6%[13-14]，頭孢曲松的耐藥率范圍為0.4%～1.6%[15-16]，其低敏率范圍為1.1%～55.8%[17-18]。

我國各地區(qū)已發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示，淋球菌對青霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星的耐藥率非常之高，對阿奇霉素也表現(xiàn)出一定的耐藥性，同時對頭孢類抗生素、大觀霉素的敏感性近年來都有所下降。近7年國內(nèi)文獻(xiàn)顯示，我國各地區(qū)淋球菌對青霉素的耐藥率范圍為51.16%～98.9%，產(chǎn)青霉素酶淋球菌(penicillinase-producingNeisseria gonorrhoeae, PPNG)的百分率范圍為13.73%～42.41%[19-22]；四環(huán)素耐藥率范圍為57.7%～100%，抗四環(huán)素淋球菌(tetracyclineresistantNeisseria gonorrhoeae, TRNG)百分率范圍為12.5%～66.84%[19,22-24]；環(huán)丙沙星耐藥率范圍為39.83%～100%，其高度耐藥率范圍為42%～52.3%[25-27]；阿奇霉素耐藥率范圍為3.1%～29.9%[28-29]；大觀霉素耐藥率范圍為0.13%～6.25%[30-31]；頭孢曲松耐藥率范圍為0.5%～4.2%，其低敏率范圍為1.85%～12.2%[32-33]。廣東、河南和貴州檢出多重耐藥的淋球菌[28,34-35]。

2 大觀霉素在淋病治療方案中的作用

大觀霉素作為氨基糖苷類抗生素，能與16S rRNA相互作用，從而在肽鏈延長的過程中，阻遏延伸因子(elongation factor G, EF-G)將肽基tRNA從A位催化轉(zhuǎn)運(yùn)至P位，抑制蛋白的翻譯。簡而言之，大觀霉素結(jié)合細(xì)菌的30S核糖體亞基，從而抑制蛋白的翻譯，產(chǎn)生抑菌的作用[36]。

在20世紀(jì)40年代，青霉素是治療淋病的主要藥物，但到了20世紀(jì)60年代早期，淋球菌中出現(xiàn)了產(chǎn)青霉素酶淋球菌(penicillinase-producingNeisseria gonorrhoeae, PPNG)，而青霉素?zé)o法治愈罹患該種淋病的患者。在這種情況下，大觀霉素作為特效藥用于治療這些患者。之后，隨著PPNG的流行率超過5%，大觀霉素于1981年在駐韓美軍中開始作為一線藥物用于淋病治療[37]。

在大觀霉素作為特效藥用于淋病治療后的1967年，荷蘭首次報道了在青霉素敏感的淋球菌中出現(xiàn)了大觀霉素抗性。另外，1981年在菲律賓出現(xiàn)了同時耐青霉素和大觀霉素的淋球菌。同時，1983年在英國倫敦出現(xiàn)了許多耐大觀霉素淋球菌。并且，1985年駐韓美軍中大觀霉素治療淋病的臨床失敗率達(dá)到8.2%。隨后，全球范圍便不再推薦用于治療淋病的單一療法[37]。

目前，淋球菌對大觀霉素的耐藥，特別是高水平耐藥，在全球非常少見。但如果將其作為一線治療藥物治療淋病，可能會導(dǎo)致淋球菌對其耐藥率的升高。大觀霉素對口咽部淋病的治療效果不佳，使得其應(yīng)用范圍小于頭孢類抗生素，特別是在男同性戀人群中，大觀霉素的有效率更低。所以，許多國家和地區(qū)不將大觀霉素作為治療淋病首選抗生素，特別是不用于口咽部淋病的治療，但可用于頭孢類抗生素治療失敗的淋病患者的治療[38]。

各國或地區(qū)的淋病治療方案中，頭孢曲松是大多數(shù)國家所使用的首選治療藥物，但是，由于淋球菌對頭孢曲松的敏感性下降，特別是日本等出現(xiàn)對頭孢曲松耐藥的淋球菌，提示未來使用頭孢曲松治療淋病的嚴(yán)峻性[1]。大觀霉素雖然不作為治療淋病的首選藥物，但它在許多國家或地區(qū)的方案中，仍然作為一個替代治療藥物發(fā)揮作用。

韓國在2002—2006年，使用大觀霉素對大部分的淋病患者進(jìn)行治療，并且2009—2012年的情況也與之類似。雖然韓國普遍使用大觀霉素治療淋病，但淋球菌對大觀霉素的敏感性依舊很高，目前大觀霉素在韓國作為推薦抗生素用于淋病的治療[5]。其他國家和地區(qū)淋病治療方案中大觀霉素的使用情況見表1。

3 淋球菌對大觀霉素耐藥機(jī)制

對于淋球菌，大觀霉素是一種外界刺激因子，當(dāng)大觀霉素作用于淋球菌時，將導(dǎo)致淋球菌產(chǎn)生一系列的細(xì)胞反應(yīng)，引起淋球菌對環(huán)境適應(yīng)性的改變和蛋白表達(dá)水平的變化，這些變化也在一定程度上促進(jìn)淋球菌對大觀霉素產(chǎn)生耐藥。淋球菌對大觀霉素耐藥的產(chǎn)生機(jī)制可以歸納為以下幾類：①抗生素的酶解或修飾；②靶標(biāo)的修飾或保護(hù)，以降低其與抗生素的親和性[37]。

3.1 淋球菌對大觀霉素的反應(yīng)

3.1.1 淋球菌對抗生素環(huán)境的適應(yīng)性

一般而言，在有相應(yīng)抗生素的體內(nèi)和體外環(huán)境中，耐藥細(xì)菌相對于敏感細(xì)菌更有競爭優(yōu)勢，而在沒有相應(yīng)抗生素的環(huán)境中，耐藥細(xì)菌的適應(yīng)性普遍比敏感細(xì)菌低。但是，耐藥淋球菌(resistantNeisseria gonorrhoeae, R-NG)相對于敏感淋球菌(spectinomycin sensitiveNeisseria gonorrhoeae, S-NG)，其適應(yīng)性并不降低，原因在于mtrCDE外排泵操縱子的去阻遏作用[37]。

在一個BALB/c雌性小鼠下生殖道感染模型中，mtrD或mtrE的無效突變(null mutation)導(dǎo)致MtrCDE外排泵功能喪失，使得淋球菌持續(xù)感染的能力降低，這可能是由于細(xì)菌無法通過MtrCDE外排泵排出來源于宿主的疏水劑。此外，mtrR作為mtrCDE阻遏蛋白MtrR的基因，對它的無效突變將導(dǎo)致mtrCDE的過表達(dá)，從而使得R-NG在體內(nèi)環(huán)境中的適應(yīng)性提高。與之相反，對mtrA(mtrCDE的激活蛋白MtrA的基因)的無效突變，導(dǎo)致mtrCDE誘導(dǎo)性過表達(dá)的功能喪失，使得R-NG在體內(nèi)環(huán)境中的適應(yīng)性降低[45]。

表1 各國(地區(qū))淋病治療方案中大觀霉素的使用情況Tab. 1 Application of spectinomycin for treatment of gonorrhea in different countries

另外，由于抗生素的廣泛使用，由此造成的選擇壓力使得某些R-NG相對于S-NG在體外和體內(nèi)環(huán)境中具有更好的適應(yīng)性。再者，細(xì)菌的補(bǔ)償突變、穩(wěn)定突變和修復(fù)突變等特性能在保持其抗生素耐藥性的同時維持其在體內(nèi)和體外環(huán)境的適應(yīng)性。淋球菌的MtrCDE外排泵的功能和外界環(huán)境中抗生素的選擇壓力，使得青霉素、四環(huán)素、氟喹諾酮類藥物不用于治療淋病的多年之后，全球范圍內(nèi)仍然有相當(dāng)比例的相關(guān)R-NG流行[46]。

目前沒有發(fā)現(xiàn)淋球菌對大觀霉素的耐藥機(jī)制中包含了MtrCDE外排泵，所以自20世紀(jì)60年代用于淋病的治療以來，雖然出現(xiàn)了對大觀霉素耐藥的淋球菌，但在不推薦作為一線治療淋病藥物之后，淋球菌對大觀霉素的敏感性得到恢復(fù)。

3.1.2 大觀霉素引起淋球菌的蛋白表達(dá)水平變化

大觀霉素進(jìn)入淋球菌胞質(zhì)會破壞細(xì)胞膜的完整性[47]。Nabu等[36]對大觀霉素耐藥菌株(spectinomycin resistantNeisseria gonorrhoeae, SR-NG)和敏感菌株(spectinomycin sensitiveNeisseria gonorrhoeae, SS-NG)分別在無抗生素和低于大觀霉素最低抑菌濃度(subminimum-inhibitory-concentration, subMIC)的條件下所表達(dá)蛋白的水平進(jìn)行比較，探索了大觀霉素和淋球菌相互作用時，淋球菌的蛋白組學(xué)圖譜。

研究發(fā)現(xiàn)，不管是SR-NG還是SS-NG，在subMIC的條件下，Rmp、DLDH、MQO、L7/L12、谷氨酸脫氫酶和過氧化物還原酶的表達(dá)均上升，氨基酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器底物結(jié)合蛋白(amino acid ATP binding cassette transporter substrate-binding protein,aa-SBP)的表達(dá)降低。Rmp屬于OmpA家族，是淋球菌主要的外膜蛋白組分之一，在淋球菌中起到維持細(xì)胞膜完整性的功能；DLDH和MQO參與了細(xì)菌的新陳代謝，它們表達(dá)的增高可能反應(yīng)了淋球菌在不利于其生長的環(huán)境中為了維持其新陳代謝形成的適應(yīng)性表現(xiàn)；谷氨酸脫氫酶和過氧化物還原酶參與細(xì)菌應(yīng)對環(huán)境因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激的抵抗機(jī)制；L7/L12在蛋白合成以及EF-G功能實(shí)現(xiàn)的過程中發(fā)揮了重要的作用，其表達(dá)的上調(diào)可能是淋球菌為了克服蛋白合成抑制劑對翻譯抑制的補(bǔ)償機(jī)制；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器作為大觀霉素進(jìn)入的孔道，aa-SBP表達(dá)的減少，起到抑制大觀霉素進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的作用。而在無大觀霉素的情況下，SR-NG相對于SS-NG，其EF-Tu和EF-Ts的表達(dá)上調(diào)，起到促進(jìn)蛋白翻譯的作用[36]。淋球菌對大觀霉素引起的蛋白表達(dá)的水平變化，在一定程度上反應(yīng)了淋球菌對外界環(huán)境刺激因子的適應(yīng)性變化。

3.2 藥物失活

近年研究發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性菌中的腺苷轉(zhuǎn)移酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶可使大觀霉素失活，從而導(dǎo)致細(xì)菌對大觀霉素耐藥。其中腺苷轉(zhuǎn)移酶有兩組，分別是ANT(3'')和ANT(9)。ANT(3'')是最常見的腺苷轉(zhuǎn)移酶，編碼它們的基因通常稱為aadA，目前至少有22種相關(guān)的基因，其以基因盒的形式嵌入整合子、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子，廣泛存在于革蘭陰性菌中；ANT(9)分為兩種，分別是ANT(9)-Ia和ANT(9)-Ib，編碼它們的基因也被稱為ant(9)-Ia和ant(9)-Ib，前者首先發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌中，后者發(fā)現(xiàn)于糞腸球菌。磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(9)目前發(fā)現(xiàn)有兩種，分別為APH(9)-Ⅰa和APH(9)-Ⅰb，前者發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團(tuán)菌，在氨基糖苷類抗生素中，只與大觀霉素結(jié)合[47]。

3.3 藥物作用靶點(diǎn)的改變

大觀霉素的作用靶點(diǎn)是16S rRNA，其34螺旋區(qū)域中C1192U的點(diǎn)突變會導(dǎo)致淋球菌對大觀霉素高水平的耐藥[48]。另外，30S核糖體蛋白S5的21～25位氨基酸形成的環(huán)形結(jié)構(gòu)，能與16S rRNA的34螺旋區(qū)域結(jié)合，也參與到大觀霉素與核糖體的結(jié)合，該蛋白Val25的缺失和K26E的改變會導(dǎo)致淋球菌對大觀霉素高水平耐藥[49]，T24P的改變也會導(dǎo)致淋球菌對大觀霉素低水平耐藥[50]，可能是由于S5的改變擾亂了大觀霉素與16S rRNA的結(jié)合，導(dǎo)致淋球菌對大觀霉素耐藥。

4 展望

淋病作為常見性病之一，其病原體淋球菌所表現(xiàn)出的抗生素耐藥性一直被各國重視，并且各國政府和組織長期監(jiān)測淋球菌對相關(guān)抗生素的耐藥率。對抗生素耐藥機(jī)制的研究，特別是對相關(guān)耐藥基因的研究，能優(yōu)化耐藥監(jiān)測的手段，指導(dǎo)精準(zhǔn)治療，如檢測相關(guān)耐藥基因，相對于瓊脂糖稀釋法，能極大地縮短監(jiān)測的時間和減少監(jiān)測的成本，及早知曉耐藥情況，從而指導(dǎo)精準(zhǔn)用藥，能在一定程度上緩解淋球菌對抗生素耐藥的嚴(yán)峻形勢。另外，闡明淋球菌對抗生素的耐藥機(jī)制，有助于針對性地開發(fā)新藥，同時指導(dǎo)藥物的聯(lián)合治療。淋球菌對大觀霉素的耐藥機(jī)制中不包括MtrCDE外排泵，對大觀霉素耐藥的淋球菌，在外界環(huán)境中其適應(yīng)性相對于S-NG低。如果謹(jǐn)慎使用大觀霉素，能使淋球菌長期保持對大觀霉素敏感性，為新藥的研發(fā)或其他治療手段的發(fā)現(xiàn)提供更充足的時間。