泛素化在腦缺血-再灌注損傷中的研究進(jìn)展

張娟 殷博凱 郭艷芹 何治

翻譯后蛋白修飾可以動(dòng)態(tài)地重新規(guī)劃細(xì)胞蛋白的特性和功能，以應(yīng)對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境失衡，泛素化就是其中一種[1]。泛素可以影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、定位、相互作用力和功能，在生理?xiàng)l件下泛素化對(duì)大部分真核細(xì)胞至關(guān)重要，并且在氧化應(yīng)激、基因毒性、熱應(yīng)激等應(yīng)激條件下其重要性更加突顯[1]。研究表明，局灶性腦缺血和全腦缺血后，泛素化底物蛋白水平升高[2]。腦缺血后泛素化水平的升高是一個(gè)尚未被充分研究的領(lǐng)域，更好地理解泛素化有助于開(kāi)發(fā)新的卒中治療方法。筆者旨在對(duì)泛素化的研究進(jìn)展、泛素化與應(yīng)激的關(guān)系、泛素化與神經(jīng)細(xì)胞的關(guān)系、泛素化與腦缺血-再灌注損傷的關(guān)系、腦缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)的泛素化類(lèi)型及腦缺血后泛素化升高的潛在因素進(jìn)行綜述。

1 泛素化

1.1 泛素化過(guò)程

在真核細(xì)胞中，泛素化是泛素(一類(lèi)低分子量的蛋白質(zhì))分子以泛素單體或泛素鏈形式與底物蛋白共價(jià)結(jié)合時(shí)發(fā)生的一種高度通用的翻譯后蛋白修飾過(guò)程[1]。泛素具有7個(gè)賴(lài)氨酸位點(diǎn)(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)和位于N端的甲硫氨酸位點(diǎn)，易發(fā)生自泛素化進(jìn)而延伸形成不同類(lèi)型的多聚泛素鏈[3]。泛素分子與底物的結(jié)合需要活化酶、偶聯(lián)酶和連接酶的連續(xù)作用，在第1步中，活化酶水解三磷酸腺苷將1個(gè)泛素分子腺苷酰化，通過(guò)活化中心的半胱氨酸殘基與泛素C端甘氨酸形成硫酯鍵來(lái)活化泛素，之后泛素依次轉(zhuǎn)移到偶聯(lián)酶和連接酶，連接酶進(jìn)而招募特定底物蛋白并使賴(lài)氨酸殘基的氨基與泛素分子的C端羧基形成異肽鍵，從而完成泛素化修飾[4]。底物蛋白被蛋白酶體識(shí)別前，必須被標(biāo)記至少4個(gè)泛素分子(以多聚泛素鏈形式存在)[3]。

1.2 泛素化的復(fù)雜性

泛素顯著影響蛋白質(zhì)功能，一方面源于結(jié)合系統(tǒng)的復(fù)雜性，另一方面源于泛素形成不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)聚合物的能力[5]。雖然哺乳動(dòng)物細(xì)胞中只有2種活化酶，但約有40種偶聯(lián)酶和600種連接酶，它們有可能以一種混合搭配的方式協(xié)同工作產(chǎn)生約25 000種不同的結(jié)合對(duì)，特異地驅(qū)動(dòng)底物蛋白，還有100多種去泛素酶也可以從底物中去除泛素[6]。除了結(jié)合系統(tǒng)的多樣性，泛素化的復(fù)雜還因其具有8個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，形成至少8個(gè)不同的聯(lián)系[3]。雖然不常見(jiàn)，但也能觀(guān)察到混合鏈，即在1個(gè)泛素分子中同時(shí)有2種及以上賴(lài)氨酸位點(diǎn)進(jìn)行鏈接[7]。泛素還可以作為單體附著在底物蛋白中的1個(gè)或多個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)上[7]。不同的泛素鏈具有不同的功能，因此泛素化蛋白的命運(yùn)嚴(yán)重依賴(lài)于相關(guān)泛素的結(jié)構(gòu)。除少數(shù)情況外，K48鏈作為降解信號(hào)，K11和K29鏈也作為蛋白酶體識(shí)別進(jìn)行降解的信號(hào)[8]。相反，泛素單體、K63鏈及甲硫氨酸鏈?zhǔn)峭耆豢山到獾男盘?hào)[9]。這是由于K11、K29和K48聚合物的三維形狀與甲硫氨酸鏈、K63鏈及泛素單體不同[9]。因此，單體分子泛素化與通過(guò)不同鏈的泛素化具有完全不同的修飾，它們以不同的方式?jīng)Q定蛋白質(zhì)的命運(yùn)。

1.3 泛素化的重要性

在任一特定的時(shí)間，細(xì)胞中有超過(guò)5 000種蛋白質(zhì)被泛素化，約占人類(lèi)編碼蛋白質(zhì)的1/4[10]。因此，泛素化對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的影響巨大。20世紀(jì)80年代初泛素化被發(fā)現(xiàn)初期，僅被作為蛋白降解信號(hào)。隨著研究的深入，逐漸認(rèn)識(shí)到泛素化與細(xì)胞眾多過(guò)程密切相關(guān)，包括細(xì)胞周期控制、酶激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)、受體轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)和凋亡等[5]。

2 泛素化與應(yīng)激

除了控制重要的生理功能外，泛素系統(tǒng)在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中也起著重要的作用。泛素偶聯(lián)物的增加可發(fā)生在所有類(lèi)型的應(yīng)激過(guò)程中，如熱休克、氧化劑、重金屬、DNA損傷劑等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括神經(jīng)細(xì)胞，在應(yīng)激的誘導(dǎo)下增加了泛素?cái)?shù)量[11]。此外，泛素活化酶、偶聯(lián)酶和連接酶的活性和表達(dá)也隨著應(yīng)激反應(yīng)而升高[11]。泛素對(duì)細(xì)胞的保護(hù)是通過(guò)降解和非降解機(jī)制介導(dǎo)的，如被K48泛素修飾的蛋白質(zhì)會(huì)被26S蛋白酶體識(shí)別并降解[9]。另外，雖然非降解泛素鏈在應(yīng)激反應(yīng)中的作用尚未被廣泛研究，但是K63泛素的缺失降低了細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗[12]。由于氧化應(yīng)激是缺血過(guò)程的一個(gè)組成部分，因此在缺血的神經(jīng)細(xì)胞中泛素對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)十分重要。

3 泛素化與神經(jīng)細(xì)胞的關(guān)系

4 泛素化與腦缺血-再灌注損傷的關(guān)系

腦缺血帶給受影響的大腦區(qū)域細(xì)胞巨大壓力，而腦細(xì)胞對(duì)這種壓力的反應(yīng)之一就是泛素化的增加。1991年Hayashi等[18]首次發(fā)現(xiàn)腦缺血會(huì)升高大鼠海馬區(qū)域泛素免疫反應(yīng)活性，并出現(xiàn)大量泛素化相關(guān)蛋白。Hayashi等[19]后續(xù)報(bào)道了沙鼠皮質(zhì)和海馬局部缺血-再灌注早期泛素化增加，30～60 min達(dá)到峰值，12～24 h趨于消退。在大鼠和小鼠局灶性腦缺血2種模型中，泛素化需要再灌注，這是由于在再灌注前，缺血組織中對(duì)泛素結(jié)合至關(guān)重要的三磷酸腺苷供應(yīng)受到限制。另外，再灌注為泛素化提供誘導(dǎo)信號(hào)，如通過(guò)產(chǎn)生自由基或激活與興奮毒性等相關(guān)的信號(hào)級(jí)聯(lián)[19-20]。大鼠純?nèi)毖鯎p傷在缺氧后恢復(fù)期并未增加泛素化，這表明血流量的缺乏和重建可能對(duì)泛素化的激活至關(guān)重要[21-22]。然而，需要更多的研究來(lái)證實(shí)這一點(diǎn)，因?yàn)槠渲幸豁?xiàng)研究采用的是輕度缺氧(15%的氧氣濃度)，機(jī)體的代償系統(tǒng)可能會(huì)緩解缺氧帶來(lái)的壓力[21]；另一項(xiàng)研究是在未成熟的大腦中進(jìn)行，未成熟大腦某些神經(jīng)傳遞系統(tǒng)發(fā)育不成熟或相關(guān)酶供應(yīng)不足，不能有效地引起泛素化的增加[22]。

目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，缺血后泛素化可通過(guò)再灌注立即誘導(dǎo)，并在梗死周?chē)哂猩鏉撃艿纳窠?jīng)細(xì)胞中檢測(cè)到[20]。在全腦缺血模型中，易受缺血應(yīng)激影響的海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)泛素化程度增加[23]。在損傷后恢復(fù)正常形態(tài)的神經(jīng)細(xì)胞中，泛素化的升高是短暫的，而在死亡的神經(jīng)細(xì)胞中泛素化水平很高[23]。在腦缺血大鼠中，低溫可保存缺血后海馬CA1區(qū)泛素免疫反應(yīng)活性，減少缺血后泛素化的啟動(dòng)[24]。雖然經(jīng)過(guò)治療的腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)泛素化水平降低[25]，但是泛素化的升高可能不是神經(jīng)細(xì)胞死亡的原因，而是防止這些神經(jīng)細(xì)胞立即死亡的補(bǔ)償性保護(hù)機(jī)制的一部分[26]。某些缺血模型中泛素化的減少可能是由于缺血程度輕致神經(jīng)細(xì)胞壓力較小[27]。泛素化在再灌注開(kāi)始后、任何細(xì)胞死亡發(fā)生之前，以及在未造成任何損害的損傷后，均可立即和短暫地升高[22]，并且泛素化水平會(huì)隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，這可能只是反映了更高的應(yīng)激水平[27]。

5 腦缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)的泛素化類(lèi)型

為了預(yù)測(cè)泛素化對(duì)靶蛋白的影響，有必要評(píng)估相關(guān)泛素類(lèi)型。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，全腦缺血模型中普遍存在的泛素鏈包括K6、K11、K48、K63鏈[28]。局灶性缺血模型中，用賴(lài)氨酸特異性抗體檢測(cè)到K48和K63鏈[29]?？山到夂筒豢山到夥核劓湹拇嬖诒砻?，蛋白酶體介導(dǎo)的降解作用減少不是缺血后泛素化水平升高的唯一原因。在Psmc1基因敲除抑制26蛋白酶體表達(dá)的小鼠中，局灶性腦缺血后不能誘導(dǎo)代表不可降解信號(hào)的K63泛素鏈[18]，提示缺血后泛素化水平升高存在其他機(jī)制。

6 腦缺血-再灌注損傷后泛素化升高的潛在因素

對(duì)大鼠短暫性腦缺血前后泛素基因的差異表達(dá)進(jìn)行分析顯示，相關(guān)基因表達(dá)的增加發(fā)生得太晚，無(wú)法解釋缺血后泛素化的增加，也證實(shí)泛素化的升高不是由于泛素化相關(guān)底物蛋白的增加[30]，因?yàn)榈孜锏鞍椎脑黾颖厝话殡S著自由泛素的耗損[20]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，泛素化水平的增加涉及多方面因素。

6.1 泛素結(jié)合機(jī)制成分變化

Hsc70羧基末端反應(yīng)蛋白是一種泛素連接酶，在應(yīng)激過(guò)程中控制伴侶蛋白的活性和水平。其在體外海馬切片中的過(guò)表達(dá)，可防止氧糖剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡[31]。然而，神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育抑制蛋白4 (neuralprecursor cell-expressed developmentally down-regulated 4，Nedd4)作為一種泛素連接酶在神經(jīng)細(xì)胞局部缺血時(shí)表達(dá)增加，提示它們與神經(jīng)保護(hù)有關(guān)[32]。Nedd4適配器蛋白(Nedd4 family interacting protein 1，Ndfip1)可在卒中過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)作用，因?yàn)镹dfip1敲除小鼠表現(xiàn)出更大的梗死體積[33]。腦缺血后蛋白水平改變的另一泛素連接酶是帕金蛋白。成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的氧糖剝奪及小鼠局灶性缺血均能降低帕金蛋白水平，導(dǎo)致線(xiàn)粒體破碎和潛在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[34]。與其他泛素連接酶一樣，帕金蛋白也具有神經(jīng)保護(hù)作用。綜上所述，缺血后泛素水平的升高可能是泛素結(jié)合機(jī)制成分變化所致。

6.2 泛素去結(jié)合機(jī)制成分變化

泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin carboxy terminal hydrolases L1，UCH-L1)是一種在神經(jīng)細(xì)胞中高表達(dá)的去泛素酶，其在帕金森病和阿爾茨海默病中的保護(hù)作用引起了人們的關(guān)注[35]。與神經(jīng)退行性變性疾病類(lèi)似，UCH-L1過(guò)表達(dá)可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受缺氧損傷[36]，而成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中UCH-L1活性下調(diào)可增加氧糖剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[37]。UCH-L1被缺氧藥物抑制24 h后，會(huì)增加原代神經(jīng)細(xì)胞的泛素化蛋白表達(dá)[36]。另一個(gè)可能在卒中和神經(jīng)退行性變性疾病中起作用的去泛素酶是泛素特異性蛋白酶14(ubiquitin specific protease14，USP14)，它通過(guò)修飾K48鏈調(diào)控泛素化蛋白的蛋白酶體降解[38]。抑制USP14能增強(qiáng)蛋白酶體活性促進(jìn)Tau蛋白降解，在阿爾茨海默病細(xì)胞模型中具有保護(hù)作用[39]。注射特定的USP14抑制劑可減輕局灶性缺血小鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷，這種保護(hù)作用可能與缺血24 h后檢測(cè)到的蛋白酶體活性增強(qiáng)和泛素化蛋白減少有關(guān)[40]。目前不清楚泛素化蛋白的減少是否具有神經(jīng)保護(hù)作用，或者只是在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)上減少損傷的一種措施。需要更多的研究來(lái)觀(guān)察早期的再灌注時(shí)間，以便在缺血后將USP14與泛素化連接起來(lái)。

6.3 泛素化結(jié)合物清除減少

6.3.1蛋白酶體：蛋白酶體是一種有多種蛋白水解酶活性的多亞基復(fù)合物，具有泛素依賴(lài)性。泛素化增加可能是由于蛋白酶體對(duì)泛素化相關(guān)蛋白降解減少而引起，經(jīng)典的26S蛋白酶體活性在缺血和再灌注期間明顯降低[20,40]，如通過(guò)預(yù)處理維持缺血后蛋白酶體活性的大鼠，可以減少短暫全腦缺血后的蛋白質(zhì)泛素化[41]。但是轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)一種增強(qiáng)蛋白酶體降解的蛋白酶體適配器蛋白后，小鼠泛素化水平卻降低[42]。因此，蛋白酶體抑制和泛素化之間的因果關(guān)系尚未確定，腦缺血后泛素化蛋白的富集是否為蛋白酶體損傷的直接結(jié)果有待進(jìn)一步研究。

蛋白酶體抑制劑可在各種卒中模型中提供神經(jīng)保護(hù)，如缺血后靜脈、腹腔和產(chǎn)前注射蛋白酶體抑制劑MLN519、硼替佐米、CVT-634和BSc2118可導(dǎo)致神經(jīng)保護(hù)[43]。但這些研究均未證實(shí)蛋白酶體抑制劑對(duì)腦蛋白酶體活性的抑制作用，而且不清楚這些抑制劑能否跨越血-腦屏障。這些抑制劑可能通過(guò)一種腦獨(dú)立的機(jī)制減輕缺血后的神經(jīng)炎性反應(yīng)和血-腦屏障的破壞來(lái)發(fā)揮作用[44]。因此，無(wú)法肯定蛋白酶體抑制劑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的途徑。

6.3.2自噬：除蛋白酶體外，泛素化相關(guān)蛋白的清除也可以通過(guò)自噬來(lái)完成，自噬主要負(fù)責(zé)回收細(xì)胞器和大的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)，也可以消化更大的泛素化聚集體。缺血后自噬調(diào)控研究較少，關(guān)于腦缺血后自噬是受損還是激活的報(bào)道相互矛盾。一項(xiàng)研究表明，在體內(nèi)和體外缺血后的再灌注過(guò)程中，自噬持續(xù)上調(diào)，再灌注過(guò)程中阻斷自噬會(huì)增加梗死體積和細(xì)胞死亡[45]。相反，在另一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，缺血后的自噬通量下降，尤其是在死亡神經(jīng)細(xì)胞中[46]。因此，不能確定這是否與泛素化蛋白的早期增加有關(guān)。

缺血后蛋白泛素化在缺血區(qū)邊緣神經(jīng)細(xì)胞中迅速、短暫增加，且這種增加依賴(lài)于再灌注。鑒于泛素化對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激反應(yīng)的重要性，這種變化對(duì)神經(jīng)細(xì)胞存活和功能的影響顯著。針對(duì)癌癥和神經(jīng)退行性變性疾病的泛素化系統(tǒng)的治療已有先例，此類(lèi)干預(yù)措施也可能適用于卒中。然而，目前對(duì)腦缺血后泛素化是如何誘導(dǎo)、泛素化涉及的酶，以及泛素化對(duì)神經(jīng)細(xì)胞和最終卒中結(jié)局的影響知之甚少。在探索調(diào)節(jié)泛素化以達(dá)到治療目的前，有必要更好地了解泛素在缺血性卒中中的作用。