枯草芽孢桿菌B1對(duì)飼喂高脂飼糧小鼠抗氧化功能的影響

徐 歆 毛予龍 李雅麗 胡勝蘭 吳紅照 李衛(wèi)芬

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院飼料科學(xué)研究所，教育部動(dòng)物分子營養(yǎng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058)

動(dòng)物機(jī)體因氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生自由基，卻又存在著一套完善的抗氧化系統(tǒng)，防止自由基的過度累積，從而使自由基處于動(dòng)態(tài)平衡之中，機(jī)體得以避免氧化損傷。當(dāng)因應(yīng)激而打破該平衡，致使自由基積累時(shí)，機(jī)體便處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而使細(xì)胞內(nèi)大分子(如脂類、蛋白質(zhì)和核酸)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能受到損害［1］。過多的能量攝入可提高機(jī)體代謝水平，顯著增加體內(nèi)自由基，引發(fā)氧化應(yīng)激［2］。所以飼喂高脂飼糧的小鼠常用作研究氧化應(yīng)激的動(dòng)物模型［3］。益生菌能夠通過促進(jìn)動(dòng)物腸道內(nèi)的菌群平衡，發(fā)揮促生長和提高抗病力等益生作用，因此已被開發(fā)為安全、有效的活菌制劑且廣泛應(yīng)用于各種畜禽和水產(chǎn)動(dòng)物飼料中，并取得了良好效果。同時(shí)，部分益生菌(如乳酸菌、雙歧桿菌和芽孢桿菌)還被發(fā)現(xiàn)具有一定的抗氧化作用。目前，關(guān)于芽孢桿菌抗氧化作用的報(bào)道不多。研究表明，納豆芽孢桿菌可顯著提高早期斷奶仔豬血清谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH－Px)活性，顯著降低血清丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量［4］;枯草芽孢桿菌可顯著提高肉雞血清與肝臟總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T－AOC)和 GSH－Px 活性，顯著降低其血清MDA、一氧化氮和肝臟 MDA含量［5］?？梢姡挎邨U菌能夠增強(qiáng)正常狀態(tài)下動(dòng)物的抗氧化功能。不過，關(guān)于氧化應(yīng)激狀態(tài)下該益生菌對(duì)動(dòng)物抗氧化功能的影響，仍有待研究。枯草芽孢桿菌B1是本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的一株具有良好抗氧化作用的芽孢桿菌。本試驗(yàn)旨在探討該菌株對(duì)飼喂高脂飼糧小鼠抗氧化功能的影響，從而為進(jìn)一步明晰芽孢桿菌的抗氧化機(jī)理提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，也為相關(guān)活菌制劑的開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

試驗(yàn)材料包括枯草芽孢桿菌B1制劑(浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所微生物與基因工程實(shí)驗(yàn)室制備，活菌數(shù)為108CFU/g)、普通ICR雄性小鼠、基礎(chǔ)飼料(浙江大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

試驗(yàn)設(shè)備包括DK－8D恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、5804R高速冷凍離心機(jī)(德國 Eppendorf公司)、T10 basic分散機(jī)(德國IKA公司)、SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

將45只(35±1)g的ICR小鼠隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只。分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對(duì)照組)、高脂飼糧(5.0%豬油+2.0%膽固醇+0.2%膽鹽+92.8%基礎(chǔ)飼糧，高脂組)和高脂飼糧+0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))枯草芽孢桿菌B1制劑(試驗(yàn)組)。每籠5只小鼠，定期更換墊料和飲水，自由采食、充足飲水，溫度25℃，濕度55%，光照12 h/d，飼養(yǎng) 30 d。

1.2.2 樣品收集與制備

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12 h，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選2只，乙醚麻醉，眼球采血。促凝采血管收集血液，37℃水浴2 h，4℃靜置12 h，3 000 r/min離心15 min，吸取上層透明淡黃色液體(即血清)至1.5 mL離心管，－80℃凍存。小鼠采血后立即頸椎脫臼處死，解剖，取肝臟和小腸。清除小腸內(nèi)容物后，縱向剖開，刮取內(nèi)層黏膜。取腸黏膜和肝臟各0.5 g，按質(zhì)量體積比1∶10加入預(yù)冷的0.9%生理鹽水，在冰浴條件下進(jìn)行充分勻漿，2 000 r/min離心 15 min，收集上清至1.5 mL離心管，－80℃凍存。

1.2.3 指標(biāo)測定

測定血清、腸黏膜和肝臟抗氧化功能相關(guān)指標(biāo)，如下:T－AOC、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、GSH－Px活性、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量、抗超氧陰離子自由基(superoxide anion radical，·)活性、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性、MDA 含量、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)活性、硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)活性、8 － 羥基脫氧鳥苷(8－h(huán)ydroxydeoxyguanosine，8－OHdG)含量，其中8－OHdG含量僅針對(duì)組織勻漿樣品。以上指標(biāo)均使用試劑盒按操作說明書進(jìn)行測定，T－AOC、SOD、GSH－Px、GSH、抗·、CAT、MDA、XOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所，TrxR和8－OHdG試劑盒購自上海拜力生物有限公司。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0軟件中的one－way ANOVA過程進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌B1對(duì)高脂飼糧小鼠腸黏膜抗氧化功能的影響

由表1可知，3個(gè)組的小鼠腸黏膜抗氧化功能各有差異。與對(duì)照組相比，高脂組腸黏膜T－AOC減少了28.34%(P＜0.01)，CAT活性降低了7.26%(P＞0.05)，GSH含量升高了 49.86%(P＜0.01)，8－OHdG 含量增加了 9.42%(P ＞0.05);與高脂組相比，試驗(yàn)組腸黏膜 T－AOC和MDA含量分別增加了32.44%(P＜0.05)和50.00%(P＜0.01)，GSH－Px活性和GSH含量分別減少了48.58%(P＜0.01)和22.88%(P ＜0.05)，XOD 活性和8－OHdG含量也分別下降了18.42%(P＞0.05)和6.86%(P＞0.05)。上述結(jié)果提示，高脂飼糧可顯著降低小鼠腸黏膜的T－AOC;添加枯草芽孢桿菌B1能顯著提高高脂飼糧小鼠腸黏膜的T－AOC，顯著降低部分抗氧化酶的活性。

表1 枯草芽孢桿菌B1對(duì)高脂飼糧小鼠腸黏膜抗氧化功能的影響Table 1 Effects of Bacillus subtilis B1 on antioxidant function in intestinal mucosa of mice fed a high－fat diet

2.2 枯草芽孢桿菌B1對(duì)高脂飼糧小鼠肝臟抗氧化功能的影響

由表2可知，3個(gè)組的小鼠肝臟抗氧化功能各有差異。與對(duì)照組相比，高脂組肝臟 SOD、GSH－Px、CAT、TrxR 活性和 T－AOC 分別降低了22.91%(P ＜0.05)、37.35%(P ＜0.01)、47.47%(P＜0.01)、36.42%(P＜0.05)和14.29%(P＞0.05)，8－OHdG含量顯著增加了 67.87%(P＜0.01);與高脂組相比，試驗(yàn)組肝臟 GSH含量、CAT和TrxR活性分別提高了38.27%(P＜0.05)、53.01%(P＜0.05)和28.13%(P＞0.05)，T－AOC、MDA 與 8－OHdG 含量和 XOD 活性分別顯著下降21.43%(P＜0.05)、16.01%(P＜0.05)、37.52%(P＜0.01)和16.25%(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，高脂飼糧能降低小鼠肝臟抗氧化酶活性，增加8－OHdG含量;添加枯草芽孢桿菌B1能緩解高脂飼糧對(duì)小鼠肝臟的抗氧化能力的削弱，提高部分抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量。

表2 枯草芽孢桿菌B1對(duì)小鼠肝臟抗氧化功能的影響Table 2 Effects of Bacillus subtilis B1 on antioxidant function in liver of mice fed a high－fat diet

2.3 枯草芽孢桿菌B1對(duì)高脂飼糧小鼠血清抗氧化功能的影響

由表3可見，3個(gè)組的小鼠血清抗氧化功能均有所差異。與對(duì)照組相比，高脂組血清GSH含量、GSH－Px和抗·活性分別下降了30.73%(P＜0.01)、47.26%(P＜0.01)和8.02%(P＜0.01)，T－AOC 提高了 9.69%(P ＜ 0.05)，MDA含量上升了6.75%(P＞0.05)。與高脂組相比，試驗(yàn)組 血 清 T－AOC、GSH 含 量、GSH－Px 和 抗·活性分別提高了10.72%(P＜0.05)、38.01%(P ＜0.05)、51.98%(P ＜0.01)和13.45%(P＜0.01)，SOD活性顯著下降了11.10%(P＜0.01)，MDA含量減少了8.85%(P＞0.05)。上述結(jié)果表明，飼喂高脂飼糧雖然提高了小鼠血清的T－AOC，但顯著降低了多種抗氧化酶的活性和抗氧化物質(zhì)的含量;而添加枯草芽孢桿菌B1能夠顯著增強(qiáng)高脂飼糧血清的T－AOC，并大幅提高大部分抗氧化酶活性。

表3 枯草芽孢桿菌B1對(duì)小鼠血清抗氧化能力的影響Table 3 Effects of Bacillus subtilis B1 on antioxidant function in serum of mice fed a high－fat diet

3 討論

機(jī)體中清除自由基的系統(tǒng)包括抗氧化酶(SOD、GSH－Px、CAT 等)和非酶抗氧化劑(GSH、維生素C、維生素E等)，能捕捉和清除機(jī)體內(nèi)的大部分過氧化物［6］。T－AOC是抗氧化物質(zhì)的功能疊加，可作為衡量機(jī)體、器官或組織抗氧化功能的主要指標(biāo)。小腸是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，脂類在其中的乳化、水解及吸收均需要消耗能量，并產(chǎn)生大量自由基［7－8］。肝是機(jī)體進(jìn)行脂肪代謝的主要場所，過量的脂肪攝入令肝細(xì)胞內(nèi)豐富的線粒體產(chǎn)生大量的活性氧簇，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和肝臟抗氧化系統(tǒng)異常，進(jìn)而引起脂肪性肝炎［9－10］。血液是機(jī)體運(yùn)送營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的載體，其攜帶的自由基部分來源于血液中的細(xì)胞，部分來自其他器官、組織、細(xì)胞。近年研究表明，機(jī)體血液自由基水平增加，抗氧化能力下降，將導(dǎo)致血漿中的脂質(zhì)發(fā)生過氧化損傷，并與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11］。因此，腸道、肝臟以及血液的抗氧化能力可較為全面地反映整個(gè)機(jī)體的抗氧化功能。本試驗(yàn)表明，高脂飼糧不同程度地削弱了小鼠腸黏膜、肝臟和血清的抗氧化功能，與前人的研究結(jié)果［12－15］相符。添加枯草芽孢桿菌B1能增強(qiáng)高脂飼糧小鼠腸黏膜、肝臟和血清的抗氧化功能，且效果血清＞腸黏膜＞肝臟。MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物之一，作為脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)反映了機(jī)體的氧化應(yīng)激水平［16］。8－OHdG被認(rèn)為是氧化應(yīng)激引起DNA氧化損傷的標(biāo)志［17］。氧化應(yīng)激狀態(tài)的評(píng)價(jià)，應(yīng)綜合考慮氧化代謝產(chǎn)物水平和氧化損傷程度［6］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂高脂飼糧可引起小鼠機(jī)體的氧化應(yīng)激，且程度肝臟＞血清＞腸黏膜;枯草芽孢桿菌B1能降低高脂飼糧小鼠腸黏膜、肝臟和血清的氧化應(yīng)激程度，效果肝臟＞血清＞腸黏膜，并減少腸細(xì)胞和肝細(xì)胞的DNA損傷。這提示枯草芽孢桿菌B1能通過減輕高脂引起的氧化應(yīng)激狀態(tài)，保護(hù)機(jī)體的抗氧化功能。由上可知，枯草芽孢桿菌B1在高脂飼糧小鼠腸黏膜、肝臟和血清中的作用方式各不相同，且抗氧化效果有所差異;該菌的抗氧化作用表現(xiàn)為增強(qiáng)和保護(hù)機(jī)體的抗氧化功能。

4 結(jié)論

①高脂飼糧降低了小鼠腸黏膜、肝臟和血清的抗氧化功能，并引起了不同程度的氧化應(yīng)激。

②添加枯草芽孢桿菌B1對(duì)高脂飼糧小鼠的抗氧化功能具有一定的增強(qiáng)作用，并能減輕機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，較好地保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化損傷。

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