復(fù)方鱉甲軟肝片對(duì)小鼠腎纖維化的防治作用*＊

熊 英，劉宗澤，李佑敬，王 嵐，秦 臻，許鍵煒

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025;2.貴州省黎平縣人民醫(yī)院急診科，貴州黎平 557300;3.貴州省從江縣人民醫(yī)院外科，貴州從江 557400;4.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，貴州貴陽(yáng) 550004;5.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025;6.貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，貴州貴陽(yáng) 550004)

糖尿病、細(xì)菌或病毒感染、自身免疫功能紊亂、藥物毒害等等原因均能引起腎臟損傷，誘發(fā)腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、腎病綜合征，還可能進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化或腎小管萎縮，即腎纖維化［1］。每年因腎臟病變發(fā)展到腎纖維化甚至腎功能衰、尿毒癥者多達(dá)數(shù)十萬(wàn)［2］，給患者造成極大的痛苦，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。復(fù)方鱉甲軟肝片是臨床用于早期肝硬化治療的中藥制劑，具有較好的抗肝纖維化作用［3］。在復(fù)方鱉甲軟肝片治療藥物誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，毒性物質(zhì)CCl4不僅對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟有致纖維化作用，對(duì)其腎臟亦具有較強(qiáng)損害并可導(dǎo)致腎纖維化，且復(fù)方鱉甲軟肝片對(duì)于腎纖維化有一定的干預(yù)作用。2018年2～9月通過(guò)建立CCl4致腎纖維化小鼠模型，并予以復(fù)方鱉甲軟肝片治療，旨在觀察復(fù)方鱉甲軟肝片對(duì)小鼠腎纖維化的防治作用，并初步探討其作用機(jī)制，為該藥物用于腎纖維化治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品、動(dòng)物 復(fù)方鱉甲軟肝片由內(nèi)蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字Z19991011。SPF級(jí)昆明種小鼠40只，體質(zhì)量約(20±2)g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(黔)2018－0001，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，動(dòng)物室通風(fēng)良好，室溫15～20℃。

1.1.2 主要試劑 Masson染色試劑盒、磷酸緩沖液(PBS)、EDTA抗原修復(fù)緩沖液(PH9.0)、蘇木素均購(gòu)自武漢金開瑞生物科技有限公司，兔抗小鼠α-SMA(ab32575)及TNF-α多克隆抗體(ab6671)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗及抗體稀釋液購(gòu)自武漢博士德公司，BSA(A8020)購(gòu)自Solarbio公司，免疫組化試劑盒DAB顯色劑(DAKO，丹麥)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及腎纖維化模型的制備 40只昆明種小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、復(fù)方鱉甲軟肝片治療組(簡(jiǎn)稱治療組)、復(fù)方鱉甲軟肝片干預(yù)組(簡(jiǎn)稱干預(yù)組)，每組10只，雌雄各半。腎纖維化動(dòng)物模型的建立:模型組、治療組、干預(yù)組均皮下注射CCl4與橄欖油等體積混合液［4－5］，劑量 0.03 mL/10 g 體質(zhì)量，每周 2 次(固定于每周一和周四下午14∶00時(shí)給藥)，持續(xù)6周;對(duì)照組以等體積橄欖油皮下注射，方法同實(shí)驗(yàn)組。造模6周后，各組分別隨機(jī)取2只小鼠處死，取腎臟行病理檢查判斷造模情況。造模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn):腎組織切片HE染色光鏡下出現(xiàn)腎小球肥大、節(jié)段性硬化或全球硬化、腎小管上皮細(xì)胞濁腫或空泡變性，腎小管出現(xiàn)明顯的擴(kuò)張或萎縮，伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)水腫或纖維化。

1.2.2 給藥方式 治療組于最后一次造模后24 h，灌胃給予復(fù)方鱉甲軟肝片，劑量為1 g/(kg·d)，連續(xù)給藥6周(藥物用生理鹽水配成50 g/L濃度，給藥體積為0.1 mL/10 g體質(zhì)量，每日2次);干預(yù)組在造模的同時(shí)即開始給與復(fù)方鱉甲軟肝片，給藥途徑、劑量、方法同治療組，連續(xù)給藥12周;模型組和對(duì)照組在造模6周后則以等體積生理鹽水灌胃。此外，為了維持腎纖維化模型狀態(tài)，模型組、治療組和干預(yù)組小鼠在造模成功后每周予CCl4橄欖油液皮下注射1次，劑量0.03 mL/10 g體質(zhì)量，直至治療結(jié)束;對(duì)照組則代以等體積橄欖油皮下注射。

1.2.3 一般情況觀察及腎功能、腎纖維化指標(biāo)檢測(cè) 觀察各組動(dòng)物精神狀態(tài)、飲食、皮毛、大、小便等一般情況，并每?jī)芍芊Q量體質(zhì)量;在治療或干預(yù)結(jié)束后，各組動(dòng)物稱量體質(zhì)量，并腹腔注射4% 水合氯醛0.1 mL/10 g體質(zhì)量，麻醉后摘眼球取血，檢測(cè)血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(serum creatinine，Scr)水平，ELISA 法檢測(cè)血清透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid，HA)、層黏連蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前膠原(procollagen Ⅲ，PC Ⅲ)、Ⅳ型膠原(Collagen typeⅣ，Ⅳ-Col)。

1.2.4 腎臟組織病理學(xué)觀察 取血后處死動(dòng)物，取雙側(cè)腎臟稱重，測(cè)算臟器指數(shù)，取左腎以4% 中性甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4.0μm薄片，按常規(guī)方法行HE染色及Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)改變。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎臟組織α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)。石蠟切片制備同“1.2.4”項(xiàng)，于60℃烤箱內(nèi)烤片60 min，二甲苯和梯度酒精常規(guī)脫蠟水化，用EDTA抗原修復(fù)緩沖液(pH9.0)微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)，待自然冷卻后PBS洗滌3次，每次5 min，3%H2O2孵育，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS中洗滌3次(方法同前)，3%BSA室溫封閉 30 min，分別滴加抗 α-SMA(1∶200)、抗TNF-α(1∶200)一抗，常溫孵育 2 h，PBS 中洗滌，滴加二抗，常溫孵育30 min，PBS洗滌，DAB溶液顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，體質(zhì)量監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析;P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

各組小鼠無(wú)死亡，造模6周時(shí)治療組、干預(yù)組和模型組小鼠活動(dòng)及進(jìn)食量較造模前減少、也少于6周時(shí)的對(duì)照組小鼠;治療組和模型組小鼠毛色明顯晦暗，精神萎靡，小便黃，大便黃、稀軟、偶爾不成形。造模6周時(shí)各組體質(zhì)量均有不同程度的增長(zhǎng)，但治療組和模型組體質(zhì)量明顯小于對(duì)照組(P＜0.05);干預(yù)組體質(zhì)量、精神、食量及毛色、大小便等接近于對(duì)照組，明顯優(yōu)于治療組和模型組。治療組行復(fù)方鱉甲軟肝片治療6周后精神、食量及毛色逐漸好轉(zhuǎn)，小便略黃，大便呈顆粒狀，體質(zhì)量增長(zhǎng)快于模型組(P＜0.05)，其他一般情況趨近于對(duì)照組。見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量( ± s，g)Tab.1 Changes of mice in all groups

表1 各組小鼠體質(zhì)量( ± s，g)Tab.1 Changes of mice in all groups

(1)與模型組比較，P＜0.05

組別 造模前造模2周 4周 6周 8周 10周 12周對(duì)照組 20.20±1.21 28.25±2.21 34.10±2.10(1)38.10±1.90(1)41.11±2.66(1)42.35±2.36(1)45.78±2.58(1)模型組 20.76±1.58 23.55±2.87 26.19±2.68 29.44±2.56 32.78±2.32 33.49±2.14 36.90±1.98治療組 21.17±2.36 24.12±2.45 27.75±2.23 30.33±2.73 34.66±3.20(1)37.54±2.68(1)41.10±2.54(1)干預(yù)組 20.48±2.80 26.90±3.64 29.37±2.75 32.26±2.47(1)36.45±3.47(1)39.02±1.12(1)42.86±2.34(1)

2.2 臟器指數(shù)

與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎臟指數(shù)顯著增高。治療組和干預(yù)組腎臟指數(shù)低于模型組(P＜0.05)，趨近于對(duì)照組。見表2。

表2 第12周時(shí)各組小鼠腎臟指數(shù)±s)Tab.2 Renal index of mice in all groups in week 12

表2 第12周時(shí)各組小鼠腎臟指數(shù)±s)Tab.2 Renal index of mice in all groups in week 12

(1)與模型組比較，P＜0.05

指標(biāo) 對(duì)照組 模型組 治療組 干預(yù)組體質(zhì)量(g) 45.78±2.58 36.90±1.98 41.10±2.54 42.86±2.34腎臟濕重(g) 0.82±0.02 1.12±0.10 0.94±0.06 0.86±0.04腎臟指數(shù) 1.79±0.02(1) 3.03±0.03 2.29±0.02(1) 2.01±0.02(1)

2.3 血清BUN及Scr

與對(duì)照組相比，模型組血清BUN和Scr均有明顯的增高(P＜0.05)，干預(yù)組BUN和Scr顯著低于模型組(P＜0.05);治療6周后，治療組血清BUN和Scr逐漸恢復(fù)，接近對(duì)照組，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 治療6周時(shí)各組小鼠血清BUN和Scr水平(±s)Tab.3 Serum BUN and Scr levels of mice in all groups in week 12

表3 治療6周時(shí)各組小鼠血清BUN和Scr水平(±s)Tab.3 Serum BUN and Scr levels of mice in all groups in week 12

與模型組比較，(1)P＜0.05，(2)P＜0.01

組別 BUN(mmol/L) Scr(μmol/L)對(duì)照組 8.01±2.62(1) 31.52±7.21(2)模型組 18.21±3.56 91.59±8.95治療組 11.34±3.81(1) 43.62±11.43(2)干預(yù)組 10.35±3.22(1) 39.27±8.21(2)

2.4 腎纖維化指標(biāo)

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中的HA、LN、PC III、Ⅳ-Col明顯增高(P＜0.05);治療組、干預(yù)組小鼠經(jīng)復(fù)方鱉甲軟肝片治療或干預(yù)后，上述纖維化指標(biāo)明顯低于模型組(P＜0.05)。見表4。

2.5 腎臟組織學(xué)

HE染色可見，模型組的腎組織出現(xiàn)廣泛水腫，腎小球明顯肥大、部分腎小球出現(xiàn)節(jié)段性硬化或全球硬化、腎小管上皮細(xì)胞濁腫、空泡變性，部分腎小管出現(xiàn)明顯的擴(kuò)張或萎縮，大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)水腫或纖維化;治療組經(jīng)復(fù)方鱉甲軟肝片治療6周后上述病理學(xué)改變顯著改善;干預(yù)組腎小球肥大和小管細(xì)胞病變不明顯。腎臟石蠟切片Masson染色檢測(cè)顯示:模型組可見較多染成藍(lán)色的膠原纖維，主要分布于球管區(qū)附近;治療組中藍(lán)色的膠原纖維逐漸減少，提示腎纖維化程度逐漸減輕;干預(yù)組腎纖維化病變不明顯。見圖1。

表4 治療6周時(shí)各組小鼠血清HA、LN、PC III及Ⅳ-Col水平( ± s，μg/L)Tab.4 Serum HA，LN，PC III and IV-Col levels

表4 治療6周時(shí)各組小鼠血清HA、LN、PC III及Ⅳ-Col水平( ± s，μg/L)Tab.4 Serum HA，LN，PC III and IV-Col levels

(1)與模型組比較，P＜0.05

指標(biāo) 對(duì)照組 模型組 治療組 干預(yù)組HA 138.53±20.44(1) 368.32±47.35 189.55±37.45(1) 155.16±40.87(1)LN 43.78±9.21(1) 110.10±11.24 74.30±12.66(1) 55.67±13.34(1)PCIII 50.23±10.36(1) 85.89±11.97 63.47±12.55(1) 54.56±9.82(1)Ⅳ-Col 42.86±7.23(1) 65.16±9.65 52.66±7.78(1) 52.93±8.77(1)

2.6 腎臟α-SMA、TNF-α蛋白的表達(dá)

對(duì)照組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整，腎小管無(wú)擴(kuò)張，胞漿內(nèi)僅偶有黃染，α-SMA、TNF-α較少陽(yáng)性表達(dá);模型組小鼠腎臟可見大量黃染，胞漿內(nèi)α-SMA、TNF-α陽(yáng)性表達(dá)(棕黃色)明顯增強(qiáng)，腎小球萎縮，腎小管塌陷，腎間質(zhì)水腫、纖維化嚴(yán)重;治療組和干預(yù)組α-SMA和TNF-α表達(dá)較模型組明顯減少。見圖2。

3 討論

腎臟纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰竭的共同通路和主要病理基礎(chǔ)［6］，延緩或逆轉(zhuǎn)腎纖維化是治療的關(guān)鍵。纖維化的發(fā)生通常被認(rèn)為與組織損傷以及創(chuàng)傷愈合的應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)，包括修復(fù)、再生、組織塑形等一系列過(guò)程。在腎纖維化的病理過(guò)程中，正常的腎小管和腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)被大量細(xì)胞外基質(zhì)所代替，并出現(xiàn)大量的肌成纖維細(xì)胞，最終表現(xiàn)為腎功能進(jìn)行性不可逆損害［7］。研究表明，膠原纖維的產(chǎn)生和沉積是纖維化發(fā)生的標(biāo)志［8－9］，HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ-Col是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，能較好的反映腎間質(zhì)纖維化的情況［10－11］，其中，HA由間質(zhì)細(xì)胞合成，能反映腎臟纖維化活動(dòng)程度，是目前抗纖維化治療中的最佳檢測(cè)指標(biāo);LN是基底膜成分中的主要糖蛋白，主要分布于腎小球基底膜的透明層，能夠與Ⅳ-Col共同作用，維持腎小球基底膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);血清PCⅢ屬于一種間質(zhì)膠原，能夠誘發(fā)纖維性新月體形成;慢性腎功能衰竭患者血清中 LN、PCⅢ、Ⅳ-Col水平異常升高。本實(shí)驗(yàn)中給予CCl4皮下注射6周后，模型組和治療組小鼠腎組織病理切片符合腎纖維化特征，血BUN和Scr較對(duì)照組顯著升高，符合腎纖維化疾病特點(diǎn)，進(jìn)一步，檢測(cè)血清HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-Col均顯著升高，說(shuō)明腎纖維化動(dòng)物模型成立。復(fù)方鱉甲軟肝片持續(xù)治療6周后，治療組小鼠腎臟組織病理變化明顯改善，腎臟指數(shù)、血BUN、Scr以及上述纖維化指標(biāo)顯著下降(P＜0.05)，說(shuō)明該藥物能夠有效逆轉(zhuǎn)CCl4引起的腎臟損傷，減少腎臟膠原的產(chǎn)生。干預(yù)組予造模同時(shí)灌胃復(fù)方鱉甲軟肝片干預(yù)，與同期模型組相比腎臟纖維化病變不明顯，上述腎纖維化指標(biāo)亦明顯低于模型組。說(shuō)明了藥物能夠一定程度上延緩腎纖維化疾病進(jìn)程。

圖1 各組小鼠腎臟病理學(xué)改變(HE，×40)Fig.1 Renal pathological changes of mice in all groups

圖2 各組小鼠腎組織α-SMA、TNF-α免疫組織化學(xué)染色(DAB，×40)Fig.2 Immunohistochemical staining result of renal tissue α-SMA，TNF-α of mice in all groups

研究證實(shí)，在纖維化進(jìn)程中α-SMA是腎間質(zhì)固有細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，腎間質(zhì)細(xì)胞活化后能大量分泌膠原形成細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和大量沉積是纖維化主要病理特征［12－13］。此外，一些細(xì)胞因子如 IL-1、TNF-α、TGF-β 也具有很強(qiáng)的促纖維化作用［14－16］，其中TNF-α除了能夠促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，還能夠與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、內(nèi)皮素-1相互作用共同促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生［17］。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察了腎臟組織中α-SMA和TNF-α的表達(dá)情況，結(jié)果顯示模型組α-SMA和TNF-α顯著高表達(dá)，治療組經(jīng)治療6周后，腎組織病理變化改善的同時(shí)，α-SMA和TNF-α表達(dá)明顯低于模型組，干預(yù)組也顯著低于模型組。說(shuō)明該藥物的作用機(jī)制與抑制炎癥因子的產(chǎn)生，抑制腎間質(zhì)固有細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的生成密切相關(guān)。

中醫(yī)認(rèn)為纖維化的根本病機(jī)是正虛邪實(shí)，其病變部位在脈絡(luò)，病機(jī)為濕熱、痰結(jié)、水滯、血瘀，病情由實(shí)而虛、由表而里、由氣入血［18］，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)腎纖維化的認(rèn)識(shí)是一致的。腎臟纖維化過(guò)程中的血流動(dòng)力學(xué)的改變、免疫介導(dǎo)凝血機(jī)制的激活以及腎臟病理改變與中醫(yī)“內(nèi)結(jié)為血瘀”有著驚人的相似。我國(guó)中醫(yī)藥在腎病的防治上歷史悠久，一些中藥及其提取物具有抗纖維化的作用。復(fù)方鱉甲軟肝片以鱉甲為主要成分，輔以莪術(shù)、赤芍、當(dāng)歸、三七等能軟堅(jiān)散結(jié)、化瘀解毒、益氣養(yǎng)血。

綜上，本實(shí)驗(yàn)研究表明了該藥物能有效改善腎纖維化小鼠腎功能指標(biāo)和組織病理學(xué)變化、降低血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-Col水平。其機(jī)制可能與抑制腎臟損傷過(guò)程中炎癥相關(guān)因子TNF-α的產(chǎn)生，減輕炎性損傷，同時(shí)減少細(xì)胞外基質(zhì)的生成相關(guān)。這將為復(fù)方鱉甲軟肝片的進(jìn)一步應(yīng)用開發(fā)提供了新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。