氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析飛龍掌血根皮油的化學成分*＊

周 威，羅才榮，劉 剛，董偉強，張曉燕＊＊，沈祥春＊＊

(1.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州貴陽 550025;2.貴州醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，貴州貴陽 550025;3.浙江科強醫(yī)藥技術(shù)有限公司研發(fā)中心，浙江 寧波 315699)

飛龍掌血為蕓香科植物飛龍掌血(Toddalia asiatica(L.)Lam.)的根或根皮，主要分布于貴州、廣西等地，具有散瘀止血、祛風止痛等功效，臨床上常用于治療風濕疼痛、跌打損傷、傷口出血等疾患［1－4］。本課題組前期圍繞飛龍掌血根皮的化學成分與止血活性，開展了一系列的研究工作［5－10］，運用以活性為導向的分離純化手段、液相高分辨質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)、體內(nèi)外活性評價相結(jié)合，證實天然香豆素類化合物是飛龍掌血根皮部位的主要藥效成分，還發(fā)現(xiàn)飛龍掌血根皮中含有大量油類。雖然迄今為止，已有飛龍掌血揮發(fā)油的研究報道［11－13］，但是未見來源于飛龍掌血根皮的脂溶性油類化學成分的研究。為了全面考察飛龍掌血根皮止血活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，本課題組利用GC-MS分析技術(shù)針對飛龍掌血根皮油的化學成分進行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 Agilent 7890B-7000C氣相色譜－三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent)，Greatwall R-1001-VN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城)，Greatwall SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城)，ZF-2型三用紫外分析儀(上海安亭)，SB-5200D型超聲波清洗器(寧波新芝)。

1.1.2 材料 95%乙醇、石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純(上海國藥)，水為雙蒸水(實驗室自制)。飛龍掌血根皮藥材采自貴州貴陽、都勻，經(jīng)貴陽中醫(yī)學院陳德媛教授、黔南民族師范學院郭治友教授鑒定為蕓香科植物飛龍掌血Toddalia asiatica的干燥根皮，標本存放于貴州醫(yī)科大學藥學院中藥民族藥標本館。

1.2 方法

1.2.1 飛龍掌血根皮油的提取 干燥的飛龍掌血根皮藥材粗粉35 kg，加3倍量95%乙醇冷浸提取9次，每次1周，合并冷浸提取液，減壓回收溶媒，濃縮至無醇味浸膏。浸膏按1∶3加水溶解分散，依次用石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇萃取。合并石油醚萃取液，經(jīng)過減壓回收石油醚至無溶劑味，得到棕褐色浸膏油溶液;吸取其上層油作為此次研究的飛龍掌血根皮油貯存在茶色玻璃瓶內(nèi)常溫保存。

1.2.2 飛龍掌血根皮油的成分分析 氣相色譜條件:HP-5MSUI(30 m ×0.25 mm，0.25 μm)氣相色譜柱，He作為載氣，柱流量1 mL/min，分流比200∶1，進樣口溫度250℃，傳輸線溫度280℃，進樣體積1μL。程序升溫:80℃初始柱溫保持3 min，15℃/min升至260℃，保持5 min。GC-MS條件:EI電離方式，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃/150℃，溶劑延遲3 min，掃描模式 MS1 Scan，循環(huán)時間400 ms，掃描范圍45～450 m/z，色譜信號采集時間3.0～20.0 min。NIST08譜庫匹配未知峰，定性分析。采用峰面積歸一化法計算各成分的相對百分含量。

1.2.3 溶液配制 空白溶劑對照樣品:以乙酸乙酯作為空白對照，所得氣相色譜圖自動扣除乙酸乙酯色譜峰。飛龍掌血根皮油待測樣品:精密移取20μL飛龍掌血根皮油樣品置于EP管中，精密加入980μL乙酸乙酯，渦旋混勻，待進樣分析。

2 結(jié)果

按上述GC-MS條件對飛龍掌血根皮油進行分析，得到飛龍掌血根皮油的總離子流圖見圖1。對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，并將所得色譜峰的質(zhì)譜信息經(jīng)安捷倫GC-MS化學工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，在質(zhì)譜庫(NIST08)中進行檢索，并結(jié)合人工解析，鑒定揮發(fā)油中的化學成分。要求匹配度＞80%，以峰面積歸一法測得揮發(fā)性物質(zhì)各組分相對含量。飛龍掌血根皮油中主要含有:(1)19 種烯烴類化合物，分別是 1 ～14，16，19，21，26和29號，總含量達到40.67%;(2)10種醇類化合物，分別是 15，17，18，20，22，23，25，27，28 和 30號，總含量為22.21%;(3)2種香豆素類化合物，分別是35和36號，含量占16.11%;(4)5種酮類化合物，分別是 24，31，37，40和 41號，含量占13.91%;(5)2種酰胺類化合物，分別是38和39號，含量占3.93%;(6)3種酯類化合物分別是32～34號，含量占3.17%。從飛龍掌血根皮油中總共鑒定出了41種脂溶性天然化合物，其中含量最多的依次是cubebol類異構(gòu)體(14.05%，22號)、pimpinellin(13.92%，35號)、β-copaene類異構(gòu)體(10.28%，8 號)、5，8-dimethoxy-2，3，10，10a-tetrahydro-1H，4aH-phenanthrene-4，9-dione(10.23%，37號)，見表1。飛龍掌血根皮油中的化學成分結(jié)構(gòu)見圖2，飛龍掌血根皮油化合物基本上都屬于雙環(huán)脂環(huán)烴類，普遍存在分子式、結(jié)構(gòu)式都一樣的多個同分異構(gòu)體，比如 cubebol、6'-formyl-2，3，4'-trimethoxy-1，1'-biphenyl等。

圖1 飛龍掌血根皮油的GC-MS分析色譜Fig.1 GC-MSchromatogram of root bark oil of Toddalia asiatica

表1 GC-MS分析鑒定出的飛龍掌血根皮油的41種化學成分Tab.1 Chemical constituents in root bark oil of Toddalia asiatica identified by GC-MS

序號 保留時間(min) 分子式 分子量 化合物名稱 CAS號 相對百分含量(%)9 10.330 C15 H24 204.351 1 an isomer of 1-isopropyl-7-methyl-4-methylene-1，2，3，4，4a，5，6，8a-octahydronaphthalene 30021－74－0 6.16 10 10.376 C15H24 204.351 1 (1S-cis)-1，2，3，5，6，8a-hexahydro-4，7-dimethyl-1-(1-methylethyl)naphthalene 483－76－1 2.42 11 10.448 C15H24 204.351 1 an isomer of 1-isopropyl-7-methyl-4-methylene-1，2，3，4，4a，5，6，8a-octahydronaphthalene 30021 －74 －0 0.93 12 10.500 C15H24 204.351 1 an isomer of(1S-cis)-1，2，3，5，6，8a-hexahydro-4，7-dimethyl-1-(1-methylethyl)naphthalene 483－76－1 3.22 13 10.630 C15 H24 204.351 1 1-isopropyl-4，7-dimethyl-1，2，4a，5，6，8a-hexahydro-naphthalene 17627－24－6 0.27 14 10.696 C15 H20 200.319 3 α-calacorene 21391－99－1 0.25 15 10.748 C15 H26 O 222.366 3 cubebol 23445－02－5 2.03 16 10.852 C15 H24 204.351 1 ［1R-(1α，3aβ，4α，7β)］-1，2，3，3a，4，5，6，7-octahydro-1，4-dimethyl-7-(1-methylethenyl)-azulene 22567 －17 －5 2.68 17 10.943 C15 H26O 222.366 3 an isomer of cubebol 23445－02－5 1.22 18 11.009 C15 H24O 220.350 4 isospathulenol 88395－46－4 0.45 19 11.074 C15 H24 204.351 1 an isomer of［1R-(1α，3aβ，4α，7β)］-1，2，3，3a，4，5，6，7-octahydro-1，4-dimethyl-7-(1-methylethenyl)-azulene 22567－17－5 1.04 20 11.120 C15 H26O 222.366 3 an isomer of cubebol 23445－02－5 0.37 21 11.256 C15 H24 204.351 1 β-guaiene 88－84－6 1.11 22 11.335 C15 H26 O 222.366 3 an isomer of cubebol 23445－02－5 14.05 23 11.380 C15 H24 O 220.350 4 an isomer of isospathulenol 88395－46－4 2.00 24 11.413 C14H22 O2 222.323 3 6-(3-acetyl-2-methyl-1-cyclopropen-1-yl)-6-methyl-2-heptanone 65868－86－2 0.37 25 11.478 C15 H26 O 222.366 3 t-muurolol 19912－62－0 0.48 26 11.602 C15 H24 204.351 1 1R，4S，7S，11R-2，2，4，8-Tetramethyltricyclo［5.3.1.0(4，11)］undec-8-ene 1000140－07－6 3.17 27 11.687 C15 H22O 218.334 6 (1R，4S)-4-Isopropyl-1，6-dimethyl-1，2，3，4-tetrahydronaphthalen-1-ol 123931－36－2 0.32 28 11.726 C15 H22O 218.334 6 an isomer of(1R，4S)-4-Isopropyl-1，6-dimethyl-1，2，3，4-tetrahydronaphthalen-1-ol 123931 －36 －2 0.46 29 11.863 C15 H24 204.351 1 an isomer ofβ-guaiene 88－84－6 1.68 30 11.902 C15 H26 O 222.366 3 an isomer of T-muurolol 19912－62－0 0.83 31 12.235 C15H26 O2 238.365 7 oplopanone 1911－78－0 1.74 32 13.363 C17H34 O2 270.450 6 hexadecanoic acid methyl ester 112－39－0 0.48 33 13.806 C18H36 O2 284.477 2 hexadecanoic acid ethyl ester 628－97－7 1.25 34 14.471 C19H34 O2 294.472 1 methyl 9-cis，11-trans-octadecadienoate 1000336 －44 －0 1.44 35 14.856 C13 H10 O5 246.215 5 pimpinellin 131－12－4 13.92 36 15.541 C13 H10 O5 246.215 5 isopimpinellin 482－27－9 2.19 37 15.750 C16 H18 O4 274.311 7 5，8-dimethoxy-2，3，10，10a-tetrahydro-1H，4aH-phenanthrene-4，9-dione 93240 －99 －4 10.23 38 16.285 C17 H26 N2 O 274.401 2 N-(1-ethyl-2，2，4-trimethyl-3，4-dihydroquinolin-7-yl)propanamide 63134－09－8 1.99 39 16.448 C17 H26 N2 O 274.401 2 an isomer of N-(1-ethyl-2，2，4-trimethyl-3，4-dihydroquinolin-7-yl)propanamide 63134－09－8 1.94 40 16.571 C16H16 O4 272.295 8 6'-formyl-2，3，4'-trimethoxy-1，1'-biphenyl 145068 －43 －5 0.47 41 16.813 C16 H16 O4 272.295 8 an isomer of 6'-formyl-2，3，4'-trimethoxy-1，1'-biphenyl 145068－43－5 1.10

圖2 GC-MS鑒定出的飛龍掌血根皮油中化學成分的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of chemical constituents in root bark oil of Toddalia asiatica identified by GC-MS

3 討論

飛龍掌血根皮是我國西南地區(qū)民間傳統(tǒng)外傷治療中藥，其根皮一直作為藥用部位用藥安全、有效。本課題組圍繞飛龍掌血根皮開展了系統(tǒng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究工作。鑒于飛龍掌血根皮含有較豐富的脂溶性油，常規(guī)分離策略并不適用于該油類成分的基礎(chǔ)研究，最終選擇GC-MS方法用于此次飛龍掌血根皮油的定性定量分析中。本研究發(fā)現(xiàn)飛龍掌血根皮含有大量C15H24系列化合物及其衍生物，大部分都屬于雙環(huán)脂環(huán)烴類，這些結(jié)果跟現(xiàn)有文獻報道一致［11－13］，提示飛龍掌血中油類成分主要存在于該植物的根皮中，也部分分布于葉中，該藥材來源植物的非根皮部位的藥用價值值得后續(xù)進一步研究。

飛龍掌血根皮油的提取方法不同于一般天然藥物揮發(fā)油的制備方法，因此在飛龍掌血根皮油GC-MS色譜圖的0～8 min保留時間里，除了扣去空白溶劑色譜峰外(0～3 min)，沒有其他色譜峰的存在。制備得到的飛龍掌血根皮油能夠代表、并合理解釋飛龍掌血根中油類成分，也是對現(xiàn)有飛龍掌血揮發(fā)油研究結(jié)果的最大補充、完善。

本研究從飛龍掌血根皮油中發(fā)現(xiàn)了pimpinellin及isopimpinellin，這與課題組前期在飛龍掌血根皮乙酸乙酯部位、飛龍掌血根皮正丁醇部位都分離得到上述兩個化合物相吻合，提示pimpinellin及isopimpinellin在飛龍掌血根皮中含量比較突出，可以合理解釋飛龍掌血根皮在臨床上治療風濕疼痛、跌打損傷、傷口出血等的物質(zhì)基礎(chǔ)［8，14］。本研究結(jié)果為飛龍掌血根皮油的鑒別和開發(fā)應用提供必要理論依據(jù)。