高度近視糖尿病豚鼠視網(wǎng)膜中骨橋蛋白及整合素αvβ3受體的表達(dá)

胡凌飛，李晨皓，梅立新，吳昌凡

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 眼科，安徽 蕪湖 241001;2.蕪湖市眼科醫(yī)院 眼科，安徽 蕪湖 241002)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetes retinopathy,DR)是糖尿病最為常見和嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，是主要的致盲眼病之一[1]?，F(xiàn)有研究表明高度近視與糖尿病視網(wǎng)膜病變的程度和分期有負(fù)關(guān)聯(lián)[2]，目前尚無確切機(jī)制解釋。有研究表明骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)同整合素αvβ3受體相結(jié)合形成的黏附蛋白分子與糖尿病視網(wǎng)膜新生血管增生具有正相關(guān)性[3]，本項(xiàng)研究為驗(yàn)證兩者表達(dá)是否與高度近視對DR進(jìn)展的影響機(jī)制有關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 實(shí)驗(yàn)以1周齡英國種健康單色雄性豚鼠(體質(zhì)量100～250g)為實(shí)驗(yàn)動物，共90只，按標(biāo)準(zhǔn)動物實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)。隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，分別為Ⅰ組(正常對照組)、Ⅱ組[高度近視組(形覺剝奪性)]、Ⅲ組(患有糖尿病組)和Ⅳ組(高度近視合并糖尿病組)。設(shè)18只正常對照組，其他實(shí)驗(yàn)組均為24只。造模于適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始。

1.2 建立動物模型方法

1.2.1 正常對照組 常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)8周，左下腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mmol/L，pH 4.4，280 mg/kg)，建立空白對照。

1.2.2 高度近視造模方法 Ⅱ組和Ⅳ組以半透明眼罩遮蓋右眼(10英寸清潔不透明氣球)8周后，散瞳驗(yàn)光(復(fù)方托吡卡胺滴眼液，帶狀光檢影法)，屈光度≥-6.00 D為成模標(biāo)準(zhǔn)，Ⅱ組豚鼠左下腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mmol/L，pH 4.4，280 mg/kg)，觀察20周。

1.2.3 糖尿病造模方法 Ⅲ組、Ⅳ組糖尿病造模待Ⅳ組高度近視模型形成后建立，左下腹腔注射5% 鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)溶液280 mg/kg 3 d后，禁食禁水10 h，經(jīng)針刺耳緣靜脈采血測定空腹血糖，空腹血糖≥16.5 mmol/L為糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)，觀察20周。

1.3 眼球標(biāo)本制作 所有試驗(yàn)豚鼠完成空腹血糖測定、散瞳驗(yàn)光后，取各組豚鼠右眼眼球標(biāo)本，應(yīng)用心尖部穿刺體循環(huán)灌注固定法快速進(jìn)行。完成后即行眼軸長度測量3次取平均值。眼球組織固定7 d后取出(4%多聚甲醛固定液)，沿視神經(jīng)方向經(jīng)視神經(jīng)切開眼球，取出晶狀體，切面朝下，脫水、媒浸、包埋、切片(厚度為4 μm)。完成若干張連續(xù)切取，并選擇連續(xù)3張，在載玻片上鋪展，分別行整合素αvβ3受體、OPN免疫組化染色及HE染色，完成區(qū)別標(biāo)記。

1.4 切片觀察方法 使用Image Pro Plus 6.0 顯微鏡成像計(jì)算機(jī)采集分析系統(tǒng)完成圖像采集。視網(wǎng)膜組織形態(tài)，細(xì)胞排列及數(shù)目應(yīng)用HE 染色，整合素αvβ3受體、OPN陽性表達(dá)情況應(yīng)用免疫組化切片觀察。兩者均在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層呈胞漿表達(dá)為淡黃至棕黃色顆粒。OPN、整合素αvβ3受體陽性表達(dá)率計(jì)算：隨機(jī)觀察每張免疫組化切片5個高倍鏡(10×40 倍)視野，記錄并計(jì)算視野內(nèi)陽性細(xì)胞總數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比值。陽性細(xì)胞率 0%、l%～20%、21%～50%、大于51%分別代表陰性(-)、弱陽性(+)、陽性()、強(qiáng)陽性()。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。造模后各組的屈光度、眼軸長度、空腹血糖以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，總體差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)；各組視網(wǎng)膜中OPN、整合素αvβ3受體陽性表達(dá)率以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，總體差異、組間兩兩比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Ⅰ組豚鼠存活率100%；Ⅱ組豚鼠的存活率100%，造模成功率為91.7%；Ⅲ組豚鼠存活率83.3%，造模成功率為83.3%；Ⅳ組豚鼠存活率為79.2%，造模成功率75%。各組隨機(jī)抽取18只成模豚鼠為研究對象。造模后各組豚鼠屈光度、眼軸長度、空腹血糖比較見表1，其中無近視組(Ⅰ、Ⅲ組)較高度近視組(Ⅱ、Ⅳ組)屈光度值低，眼軸長度短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；無糖尿病組(Ⅰ、Ⅱ組)空腹血糖值比糖尿病組(Ⅲ、Ⅳ組)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 造模后各組豚鼠屈光度、眼軸長度及空腹血糖(n=18)

注：多組間兩兩比較，字母不同表示P<0.05。

2.1 HE染色切片觀察 Ⅰ組視網(wǎng)膜各層組織厚度及細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量均正常，細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)呈紅色，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列整齊；Ⅱ組視網(wǎng)膜細(xì)胞排列紊亂，視網(wǎng)膜各層尤其是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層變??；Ⅲ組視網(wǎng)膜組織形態(tài)疏松，細(xì)胞數(shù)目少，排列錯亂，可見視網(wǎng)膜微動脈瘤、少量小動脈栓塞及靜脈血栓，提示該組豚鼠發(fā)生了糖尿病視網(wǎng)膜病變；Ⅳ組視網(wǎng)膜組織變薄、疏松，且排列紊亂，可見少量微動脈瘤，提示發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變但較Ⅲ組細(xì)胞破壞輕。

圖1 各組豚鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)改變(EnVISION×200)

2.2 免疫組化染色 結(jié)果顯示，糖尿病組(Ⅲ、Ⅳ組)OPN、整合素αvβ3受體的表達(dá)水平較無糖尿病組(Ⅰ、Ⅱ組)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在Ⅰ、Ⅱ組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Ⅳ組OPN、整合素αvβ3受體的表達(dá)水平較Ⅲ組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組豚鼠視網(wǎng)膜組織中OPN、整合素αvβ3受體的陽性表達(dá)率比較(中位數(shù)和四分位數(shù)間距)

注：多組間兩兩比較，字母不同表示P<0.05。

圖2 各組豚鼠視網(wǎng)膜 OPN 免疫組化染色 (EnVISION×200)

圖3 各組豚鼠視網(wǎng)膜整合素αvβ3受體免疫組化染色 (EnVISION×200)

3 討論

DR是糖尿病常見且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是由多種細(xì)胞因子、多途徑共同作用，導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管形成及血-視網(wǎng)膜屏障破壞，引起玻璃體視網(wǎng)膜增生性改變，最終使糖尿病患者視力喪失。故抑制促新生血管形成因子的表達(dá)，使血管內(nèi)皮損傷機(jī)制受阻，可望帶來糖尿病治療的新希望。目前掌握大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，OPN及整合素αvβ3受體在視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生視網(wǎng)膜新生血管的過程中發(fā)揮重要作用[4]。

OPN是一種增生相關(guān)蛋白，廣泛分布于人體組織中，在炎癥、肺結(jié)核、腫瘤的研究中均有表明，在新生血管形成、增生改變過程中均有OPN誘發(fā)作用[5]。有研究指出，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過OPN介導(dǎo)，與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用后分化、增殖，加速新生血管形成[6]。有學(xué)者研究結(jié)果推測增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的血管增生性改變機(jī)制與升高的OPN濃度存在相關(guān)性。在糖尿病視網(wǎng)病變增殖期患者玻璃體腔內(nèi)，OPN可具有相似的濃度升高過程[7]。OPN同整合素受體家族有效的結(jié)合是其生物學(xué)作用有效發(fā)揮的基礎(chǔ)，OPN和整合素αvβ3受體是一組相結(jié)合的黏附蛋白分子，兩者為配體與受體的關(guān)系，在新生血管形成過程中有協(xié)同功能。整合素可作為新生血管的標(biāo)志，其高表達(dá)可用來衡量侵襲性疾病和增生性疾病在治療過程中評價惡化的標(biāo)準(zhǔn)。本文研究結(jié)果顯示OPN及整合素αvβ3受體在糖尿病組(Ⅲ、Ⅳ組)豚鼠的表達(dá)水平比血糖正常組(Ⅰ、Ⅱ組)高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與其他學(xué)者研究結(jié)果一致。

近年來發(fā)現(xiàn)高度近視與DR的程度及分期有負(fù)關(guān)聯(lián)，近視、眼軸長的患者DR的發(fā)生率低，近視程度越高，DR病變程度越輕，尤其是危及視力的重度DR發(fā)生率更低[8]。提示近視度數(shù)高或眼軸長可能是DR的保護(hù)因素，已發(fā)現(xiàn)機(jī)制有：各種血管損傷因子和沖擊損傷因血流量降低而減少，視網(wǎng)膜細(xì)胞透氧環(huán)境因鞏膜變薄而得以改善，新生血管數(shù)量在玻璃體液化、后脫離后會降低[9-10]。但目前具體機(jī)制的詮釋尚未統(tǒng)一。此次研究中，糖尿病合并高度近視組豚鼠視網(wǎng)膜中OPN和整合素αvβ3受體陽性表達(dá)率均比糖尿病組低(P<0.05)，觀察各組豚鼠視網(wǎng)膜形態(tài)，糖尿病組視網(wǎng)膜破壞也比糖尿病合并高度近視組明顯。由此推測，OPN與整合素αvβ3受體結(jié)合后的協(xié)同促進(jìn)增生作用同新生血管增殖損傷具有相關(guān)性，降低視網(wǎng)膜組織破壞程度可通過抑制兩者表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

通過本研究推測高度近視對糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)展的阻滯可能是通過下調(diào)視網(wǎng)膜內(nèi)OPN和整合素αvβ3受體的表達(dá)。但具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究探討。