棕櫚酸對肝細(xì)胞自噬和凋亡的影響

杜 卉，張 揚(yáng)，孟祥健，呂康甲，吳曉莉，王李卓，邢春燕，何春玲，高家林

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 內(nèi)分泌科,安徽 蕪湖 241001;2.皖南醫(yī)學(xué)院 a.臨床醫(yī)學(xué)院;b.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,安徽 蕪湖 241002)

自噬和凋亡是真核生物體內(nèi)兩種重要的生理過程。自噬是體內(nèi)物質(zhì)降解的重要途徑，借助具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡，將降解底物運(yùn)送至溶酶體內(nèi)降解。多種體內(nèi)外刺激因素引起內(nèi)環(huán)境改變，使自噬上游調(diào)控通路被激活，ULK1/ULK2復(fù)合體活化使自噬起始，隨后在Beclin1-Vps34-Vps15復(fù)合體的作用下成核，借助Atg12-Atg 5系統(tǒng)和LC3修飾這兩個(gè)泛素樣系統(tǒng)調(diào)控自噬體膜的形成和延伸，最終形成自噬體并與溶酶體融合，底物進(jìn)入溶酶體內(nèi)降解，形成一個(gè)完整的自噬過程。細(xì)胞內(nèi)破損或衰老的細(xì)胞器、錯(cuò)誤合成或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)等可以通過自噬被降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)的相對穩(wěn)定。凋亡也是體內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞數(shù)量相對穩(wěn)定的自我平衡機(jī)制，同時(shí)可以發(fā)揮防御功能，凋亡通過caspase家族發(fā)揮作用，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞核固縮、DNA斷裂和細(xì)胞核的崩解，最終形成凋亡小體被周圍細(xì)胞吞噬。自噬和凋亡參與癌癥發(fā)病[1- 2]，脂性凋亡[3]和脂質(zhì)自噬[4]，在脂質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體病變的過程中發(fā)揮重要作用。

棕櫚酸為飽和脂肪酸，對于脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病的發(fā)病具有重要意義，飽和脂肪酸攝入過多能夠增加心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[5]，前期研究中發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)和自噬及凋亡有密切聯(lián)系，所以我們希望明確棕櫚酸對于自噬和凋亡的具體影響，從而進(jìn)一步明確脂質(zhì)與自噬和凋亡的關(guān)系，指導(dǎo)相關(guān)疾病的防治。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 小鼠正常肝細(xì)胞(AML12細(xì)胞)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection,ATCC)，人肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。棕櫚酸處理前細(xì)胞均經(jīng)過1%FBS培養(yǎng)基預(yù)處理。

1.1.2 主要材料與試劑 棕櫚酸鈉購自Sigma公司；無脂肪酸牛血清白蛋白購自生工生物公司；AML12細(xì)胞完全培養(yǎng)液(SCSP-654)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；p-mTOR、Atg5、p-erk均購自Cell Signaling Technology；Bcl2購自Proteintech；LC3B、β-actin購自美國Sigma公司；P62購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)及DAPI染色液購自碧云天公司；化學(xué)發(fā)光底物和彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(10～180 ku)購自賽默飛世爾科技；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自北京索萊寶公司；甲醇(AR)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(產(chǎn)自Millipore超純水系統(tǒng))。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 用甲醇配制棕櫚酸鈉母液，用含1%無脂肪酸牛血清蛋白的完全培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.2.2 CCK8法檢測細(xì)胞活力 細(xì)胞接種于96孔板，37℃，5%CO2預(yù)培養(yǎng)24 h，向孔內(nèi)加入10 μL不同濃度棕櫚酸溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育8 h，更換新鮮培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度。

1.2.3 DAPI染色 吸棄培液，PBS漂洗1次，加入適量DAPI染色液室溫避光染色5 min，吸棄DAPI染色液，PBS清洗3次，每次5 min，在半智能熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4 western blotting 檢測蛋白水平 處理后的貼壁細(xì)胞，PBS洗滌后加入適量蛋白裂解液，將細(xì)胞收集至潔凈的1.5 mL EP管，細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞后于冰上靜置30 min，隨后4℃、12 000 r/min離心15 min，上清即為細(xì)胞總蛋白。按照蛋白60 μg/孔上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃孵育過夜，1×TBST洗滌3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，1×TBST洗滌3次，每次10 min，ECL發(fā)光法顯影。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用Microsoft Excel 2007、SPSS 16.0和GraphPad Prism 5軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 western blotting檢測棕櫚酸對細(xì)胞的影響 不同濃度的棕櫚酸溶液孵育HepG2細(xì)胞8 h,檢測自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。mTOR是自噬調(diào)控蛋白，mTOR被抑制時(shí)，Atg13去磷酸化，形成ULK1-Atg13-FIP200復(fù)合物，促進(jìn)吞噬泡的形成；而Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物和LC3Ⅱ能夠促進(jìn)自噬體形成，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例與自噬泡的數(shù)量正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示從棕櫚酸濃度達(dá)到200 μmol/L開始，p-mTOR下降，Atg5增加，LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ增加，表明自噬開始增強(qiáng)，可能由于棕櫚酸使自噬降解底物基數(shù)增加，所以P62表達(dá)也增加，與此同時(shí)，p-erk表達(dá)增加，表明棕櫚酸可能通過Erk1/2通路發(fā)揮作用,同時(shí)發(fā)現(xiàn)Bcl2在棕櫚酸處理后表達(dá)增加(圖1、表1)。

2.2 CCK-8檢測棕櫚酸對細(xì)胞活力的影響 不同濃度棕櫚酸處理細(xì)胞，CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性，CCK-8可在電子載體的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，OD值越大，則活細(xì)胞數(shù)量越多，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著棕櫚酸濃度增高細(xì)胞數(shù)量不斷減少(圖2)。

圖1 western blotting檢測棕櫚酸對細(xì)胞的影響

表1 棕櫚酸對細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的影響

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

圖2 不同濃度棕櫚酸對AML12細(xì)胞活力的影響

2.3 棕櫚酸處理不同時(shí)間對細(xì)胞的影響 根據(jù)圖2濃度作用曲線選取200 μmol/L的棕櫚酸作用于細(xì)胞，觀察不同作用時(shí)間對細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示隨著作用時(shí)間延長，細(xì)胞活力不斷下降，存活細(xì)胞不斷減少(圖3)。

2.4 DAPI染色檢測棕櫚酸對細(xì)胞的影響 用200 μmol/L棕櫚酸作用于AML12細(xì)胞，DAPI染色檢測細(xì)胞核變化，結(jié)果顯示棕櫚酸處理后細(xì)胞核染色加深、變亮，提示核固縮(圖4)。

200 μmol/L的棕櫚酸分別作用于細(xì)胞0、6、8、12 h后細(xì)胞數(shù)量(20×)

A.正常培養(yǎng)的AML12細(xì)胞細(xì)胞DAPI染色(20×)；B.棕櫚酸處理后的AML12細(xì)胞DAPI染色(20×)。

3 討論

非酒精性脂肪肝病是常見的慢性疾病，流行病學(xué)研究顯示，在工業(yè)化國家中約有14%～27%的人口患有非酒精性脂肪肝病[6]，非酒精性脂肪肝病已經(jīng)成為慢性肝病最常見的原因[7]，但同時(shí)研究也表明非酒精性脂肪肝病在一定程度上是可逆的，肥胖病患者在進(jìn)行減肥手術(shù)后不僅肝脂肪變能夠得到好轉(zhuǎn)[8]，肝纖維化的比例也有所下降[9]，由此可見肥胖與非酒精性脂肪肝病的發(fā)病關(guān)系密切，而肥胖人群中脂肪酸的含量，則被證明是影響脂肪肝最重要的因素[10]。脂肪酸分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，而飽和脂肪酸是引起非酒精性脂肪肝病進(jìn)展的重要原因，飽和脂肪酸能夠誘導(dǎo)JNK依賴性的肝細(xì)胞脂性凋亡[11]，明確飽和脂肪酸對機(jī)體的影響，對于進(jìn)一步的疾病預(yù)防和治療具有重要意義。

許多蛋白、因子被發(fā)現(xiàn)可以通過影響自噬過程來改善或加劇NAFLD的進(jìn)程[12]，有研究顯示在肝細(xì)胞中棕櫚酸能夠通過活化JNK2通路激活自噬[13]，種種研究顯示飽和脂肪酸影響NAFLD的機(jī)制和自噬與凋亡密切相關(guān)，因此，了解飽和脂肪酸影響自噬和凋亡的機(jī)制十分必要。棕櫚酸屬于飽和脂肪酸，研究棕櫚酸對于肝細(xì)胞的作用能夠很好地幫助我們了解飽和脂肪酸影響肝臟的機(jī)制。

我們檢測了HepG2細(xì)胞在不同濃度棕櫚酸作用下自噬的變化，發(fā)現(xiàn)p-mTOR下降、Atg5及 LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ增加，說明自噬活化增加，P62增加可能是由于底物總量過多導(dǎo)致的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明棕櫚酸能夠激活自噬，但到達(dá)一定濃度后再增加棕櫚酸濃度自噬活性并不會(huì)隨之增高。Erk1/2能夠作用于mTOR繼而影響自噬，因此棕櫚酸對于自噬的影響可能是通過抑制Erk1/2通路，使p-mTOR下降，進(jìn)而激活自噬下游通路而實(shí)現(xiàn)的；此外我們也發(fā)現(xiàn)Bcl2表達(dá)增加(圖1)，Bcl2一般被認(rèn)為是抗凋亡蛋白，可以抑制細(xì)胞色素C的釋放，從而阻止凋亡的發(fā)生；同時(shí)，Bcl2能與Bcl2家族的促凋亡蛋白形成異二聚體保護(hù)細(xì)胞不進(jìn)入凋亡程序[14]。

考慮到癌癥與凋亡的密切聯(lián)系[15]，我們選擇小鼠正常肝細(xì)胞檢測凋亡的改變。CCK-8結(jié)果顯示隨著棕櫚酸濃度升高細(xì)胞存活率不斷下降(圖2)，延長棕櫚酸作用的時(shí)間，存活細(xì)胞不斷減少(圖3)，用DAPI染色發(fā)現(xiàn)棕櫚酸處理后細(xì)胞核致密、濃染，說明細(xì)胞凋亡增加；但在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白Bcl2在棕櫚酸處理后增加，我們猜想可能是棕櫚酸介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并不主要由Bcl2調(diào)節(jié)。另有文獻(xiàn)報(bào)道Bcl2家族中促凋亡蛋白及抗凋亡蛋白的表達(dá)程度并非是決定細(xì)胞凋亡的唯一因素[16]，因此細(xì)胞凋亡的程度與Bcl2的表達(dá)量可能不完全一致?？傊ㄟ^實(shí)驗(yàn)我們確定棕櫚酸可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)通過Erk1/2信號(hào)通路途徑來激活自噬。