基于GC-QTOF-MS代 謝組學(xué)技術(shù)研究飼喂不同糖飼料對(duì)蜜蜂所產(chǎn)蜂王漿中代謝物組成成分的影響

張文文，龐 倩，王 康，陳孝梅，范榮莉，陳國宏，吉 挺*

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000）

蜂王漿是由蜜蜂蜂群中的哺育蜂頭部上顎腺和咽下腺分泌的一種淡黃色或者乳白色的乳塊狀物質(zhì)，是工蜂飼喂蜂王以及蜜蜂幼蟲的一種食物[1]，對(duì)于蜜蜂的級(jí)型分化有著重要的作用，蜂群中的工蜂一般只在孵化后3 d采食蜂王漿，而孵化后一直采食蜂王漿的幼蟲則發(fā)育成蜂王[2-3]。蜂王漿含有許多生物活性成分，具有提高免疫力、抑制腫瘤、降血壓、抗菌、降血脂、抗氧化和抗疲勞等功能作用[4]。蜂王漿的成分和含量對(duì)于蜂王漿品質(zhì)的好壞也有著重要的影響[5]，而蜂種、蜂王漿的生產(chǎn)方式、生產(chǎn)時(shí)間、泌漿蜂日齡、取漿時(shí)間、飼料的種類和質(zhì)量以及外界環(huán)境、氣候等都會(huì)影響蜂王漿的成分和含量[6-9]。在蜜源缺乏時(shí)期，蜂農(nóng)選用人工飼料替代蜜粉飼喂蜂群以繼續(xù)維持蜂王漿的生產(chǎn)。李肖[10]研究表明在蜜蜂飼喂的飼料中添加不同蛋白質(zhì)水平對(duì)蜜蜂春繁時(shí)期生產(chǎn)的蜂王漿品質(zhì)有顯著影響；程艷華[11]研究表明飼喂蜜蜂不同水平的蛋白質(zhì)也會(huì)對(duì)蜂王漿中的主要成分如王漿酸、粗蛋白和粗脂肪等含量產(chǎn)生顯著影響；王改英等[12]認(rèn)為使用人工蛋白質(zhì)飼料代替花粉飼喂蜜蜂也會(huì)對(duì)蜂王漿的品質(zhì)產(chǎn)生影響。代謝組學(xué)是一門研究生物體系受到內(nèi)在或外在的刺激使自身代謝發(fā)生變化，能夠?qū)ζ渲械年P(guān)鍵物質(zhì)主要是小分子物質(zhì)進(jìn)行精確地定性定量分析的一門學(xué)科[13]，具有研究代謝物種類少、操作簡便且技術(shù)通用，可以反映出基因或蛋白表達(dá)的細(xì)微變化的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物研究、微生物研究、疾病診斷、藥物機(jī)制、中藥成分研究、營養(yǎng)學(xué)研究等多個(gè)方面[14-20]。

目前國內(nèi)外對(duì)蜂王漿的研究多集中于基于不同的蛋白營養(yǎng)水平對(duì)蜂王漿品質(zhì)的影響，而成年工蜂糖類食物對(duì)其分泌的蜂王漿品質(zhì)影響的研究也主要體現(xiàn)在粗蛋白、水分、10-羥基癸烯酸等常規(guī)指標(biāo)方面。本研究基于氣相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（gas chromatography-quadrupole time-of-flight-mass spectrometry，GC-QTOF-MS）代謝組學(xué)技術(shù)分析不同糖飼料飼喂條件下蜂王漿的組成成分差異，及對(duì)蜂王漿品質(zhì)的影響，為養(yǎng)蜂者實(shí)際生產(chǎn)（如選擇合適的人工替代飼料等）提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所選用的蜂群是本地意蜂與平湖漿蜂的雜交后代，首先從蜂群中選取300 群產(chǎn)漿性能比較優(yōu)異的實(shí)驗(yàn)蜂群，并從中隨機(jī)選擇產(chǎn)漿性能一致、健康無病且蜂種相同的90 群蜂，調(diào)整群勢至一致，隨機(jī)分為3 組，每組30 群，分別在江蘇南京六合區(qū)3 處環(huán)境相似的地方定地飼養(yǎng)。然后取同地點(diǎn)、同組隨機(jī)10 個(gè)蜂群生產(chǎn)出來的蜂王漿進(jìn)行充分混合后作為1 個(gè)樣品，每組8 個(gè)平行樣品，3 組一共采集24 個(gè)蜂王漿樣品。

內(nèi)標(biāo)物：核糖醇（CAS#：488-81-3） 美國Sigma公司；衍生化試劑：雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺（含體積分?jǐn)?shù)1%三甲基硅烷） 美國REGIS科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JXFSTPRP-24研磨儀 上海凈信科技有限公司；7890A GC-QTOF-MS聯(lián)用儀、DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的保存與運(yùn)輸

蜂場所在地位于南京市六合區(qū)，采集的蜂王漿樣本裝瓶后進(jìn)行標(biāo)記編號(hào)并立即冷凍保存，隨后保存在揚(yáng)州大學(xué)蜂產(chǎn)品研究實(shí)驗(yàn)室的冰箱中并以低溫保存的狀態(tài)送往上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司利用代謝組學(xué)技術(shù)檢測蜂王漿中組分。

1.3.2 飼喂條件

實(shí)驗(yàn)開始前45 d飼喂正常用量的花粉和花蜜，生產(chǎn)前20 d，3 組以糖和花粉質(zhì)量比1∶1分別飼喂白糖、蜂蜜和高果糖漿3 種不同的糖飼料。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 樣品萃取

每管中稱取10 mg蜂王漿樣本，置于2 mL研磨管里，然后滴加0.4 mL的甲醇-水（3∶1，V/V）提取液，再加20 μL的核糖醇，放入鋼珠，45 Hz、6 min研磨儀旋渦混勻處理；4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取上清液于2 mL進(jìn)樣瓶（甲烷硅基化）中，每個(gè)蜂王漿樣本中取8 μL混成一個(gè)樣本。

1.3.3.2 萃取物衍生化

在真空濃縮器中將提取物進(jìn)行干燥。滴加80 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg/mL）于干燥后的提取物中，輕輕吹打混勻后，放入80 ℃烘箱中烘烤20 min；迅速滴加100 μL雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺（含1%三甲基硅烷）70 ℃烘烤1 h后冷卻；向混勻的樣品中加入5 μL的飽和脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)混合液（溶于氯仿C8～C161 mg/mL，C18～C240.5mg/mL）；混勻，上機(jī)檢測。

1.3.4 GC-QTOF-MS檢測條件

DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；進(jìn)樣量1 μL，不分流模式；前進(jìn)樣口的吹掃流速3 mL/min；柱流速1 mL/min；程序升溫：柱溫80 ℃維持1 min，以10 ℃/min升溫至290 ℃，維持12 min；進(jìn)樣口溫度280 ℃；傳輸線溫度270 ℃；離子源溫度220 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z30～600；掃描速率20 spectra/s。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)通過數(shù)據(jù)預(yù)處理，主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）、差異化合物篩選和鑒定等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析，采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，以差異極顯著（P＜0.01）、差異顯著（P＜0.05）作為差異顯著性進(jìn)行判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組蜂王漿樣品總離子流圖

圖1 飼喂白糖組（A）、蜂蜜組（B）、高果糖漿組（C）蜂王漿總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms for royal jelly from sugar-fed (A), honey-fed (B) and high fructose syrup-fed honeybees (C)

由圖1可知，3 組總離子流圖色譜峰的主要保留時(shí)間都在0～26.667 min之間，但在具體同一保留時(shí)間的峰值高低、面積大小又存在著明顯的差異，表明3 種不同糖飼喂所得的蜂王漿中的一些物質(zhì)種類及含量存在差異，還需要進(jìn)一步分析。

2.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果

為進(jìn)一步得出3 種不同飼喂方式所得到的蜂王漿具體成分差異，進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理分析，采用四分位數(shù)極差對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，目的是去除噪音數(shù)據(jù)，保留所有組中空值不大于50%的峰面積數(shù)據(jù)，然后對(duì)原始數(shù)據(jù)中的缺失值進(jìn)行模擬，采用內(nèi)標(biāo)歸一法對(duì)填補(bǔ)完以后的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過質(zhì)譜分析，共檢測出201 種成分，其中未知物99 種，主要為氨基酸、脂肪酸和糖類3大類，各組中蜂王漿中小分子如表1所示，由峰面積平均值可以看出3 組不同糖飼喂的結(jié)果中，部分小分子物質(zhì)含量存在差異。

表1 GC-QTOF-MS代謝組學(xué)技術(shù)分析的小分子物質(zhì)結(jié)果Table 1 Small molecular components of royal jelly analyzed by GC-QTOF-MS-based metabolomics

續(xù)表1

2.3 PCA結(jié)果

圖2 白糖組、蜂蜜組、高果糖漿組PCA兩兩比較結(jié)果圖Fig. 2 The PCA scores plot of sugar group, honey group and high fructose syrup group

對(duì)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元變量模式識(shí)別分析，如圖2所示，3 組所有樣本均處于95%置信區(qū)間內(nèi)，對(duì)蜂蜜組與白糖組、高果糖漿組與白糖組進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)3 組間主成分均存在一定差異，具體差異物還需進(jìn)一步分析。

2.4 OPLS-DA結(jié)果

使用SIMCA軟件（V14, Umetrics AB, Umea, Sweden）對(duì)模型進(jìn)行OPLS-DA，能夠比較有效地將樣品內(nèi)部成分與預(yù)測主成分相關(guān)的差異突顯出來。如圖3A所示，置換檢驗(yàn)中R2Y表示Y變量的可解釋性，Q2表示模型的可預(yù)測性，越接近1越能很好地體現(xiàn)和說明兩組樣本間存在的差異性。置換檢驗(yàn)截距R2為0.876、Q2為－0.104體現(xiàn)出模型較好的穩(wěn)健性。蜂蜜組和白糖組樣品均比較穩(wěn)定，且2 組樣本的主成分區(qū)分很明顯，說明2 組樣本中的代謝物存在差異。如圖3B所示，R2為0.85、Q2為－0.175的置換檢驗(yàn)截距體現(xiàn)出模型很好的穩(wěn)健性。高果糖漿組和白糖組2 組樣品均比較穩(wěn)定，且2 組樣本的主成分區(qū)分很明顯，說明2 組樣本中的代謝物存在差異。如圖3C所示，置換檢驗(yàn)截距R2為0.897、Q2為－0.182體現(xiàn)出模型很好的穩(wěn)健性。高果糖漿組和蜂蜜組兩組樣品均比較穩(wěn)定，且2 組樣本的主成分區(qū)分很明顯，說明2 組樣本中的代謝物存在差異。

圖3 3 組OPLS-DA得分圖和置換檢驗(yàn)圖Fig. 3 OPLS-DA score plots and permutation test of 3 groups

2.5 差異代謝物的篩選及鑒定結(jié)果

表2 蜂蜜組與白糖組的差異代謝物結(jié)果Table 2 Differential metabolites between honey-fed and sugar-fed groups

通過OPLS-DA過濾掉不相關(guān)的正交信號(hào)從而得到明確的差異性代謝物。采用OPLS-DA模型第1主成分的變量重要性預(yù)測（variable importance in the projection，VIP）值（閾值＞1），并結(jié)合t檢驗(yàn)的P值比較分析不同組樣品中的具體差異性表達(dá)代謝物。蜂蜜組與白糖組的差異代謝物（VIP＞1，P＜0.05）結(jié)果見表2，與白糖組相比較，蜂蜜組脯氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、乳糖、癸酸、L-磺基丙氨酸含量顯著較高（P＜0.05），其中異亮氨酸、纈氨酸和乳糖差異極顯著（P＜0.01）。

表3 高果糖漿組與白糖組的差異代謝物結(jié)果Table 3 Differential metabolites between high fructose syrup-fed and sugar-fed groups

如表3所示，與白糖組相比，高果糖漿組軟脂酸、麥芽糖、蘇氨酸、半乳糖含量顯著較高（P＜0.05），其中而纖維二糖、松二糖、木糖、乳糖、赤蘚糖含量顯著較低（P＜0.05），纖維二糖、木糖和乳糖含量差異極顯著（P＜0.01）。

表4 高果糖漿組與蜂蜜組的差異代謝物結(jié)果Table 4 Differential metabolites between high fructose syrup-fed and honey-fed groups

如表4所示，與蜂蜜組相比較，高果糖漿組蔗糖、麥芽糖含量顯著較高（P＜0.05），其中麥芽糖含量差異極顯著（P＜0.01），而甘油、纖維二糖、異亮氨酸、木糖、羥脯氨酸、乳糖、L-磺基丙氨酸含量顯著較低（P＜0.05），其中纖維二糖、異亮氨酸、木糖、乳糖、L-磺基丙氨酸等含量差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論與結(jié)論

3 組不同糖飼喂的蜜蜂蜂王漿代謝產(chǎn)物中，氨基酸、脂肪酸以及糖類3 類小分子物質(zhì)差異較顯著，從氨基酸代謝物來看，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸作為蜜蜂必需氨基酸，對(duì)于蜜蜂的生長發(fā)育有著重要影響[21-23]。此外，蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸是人體必需氨基酸，對(duì)人體健康有著重要的作用[24-26]，蜂王漿作為蜂產(chǎn)品被人類所食用時(shí)，其含有各種功能成分能夠很好地補(bǔ)充人體需求，蜂王漿中的纈氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸的含量越高，其營養(yǎng)作用越高。綜合考慮，就氨基酸差異而言，蜂蜜組的蜂王漿產(chǎn)物較好，其次是高果糖漿組，最后是白糖組。

蜂王漿中的脂肪酸主要是由工蜂頭部的上顎腺分泌的，其合成途徑需經(jīng)過羥基化和β氧化以及功能基因的修飾等步驟[27]，脂肪酸的成分對(duì)于蜂群的營養(yǎng)調(diào)節(jié)以及在幼蟲的生長發(fā)育過程中作用尤為重要，也在很大程度上影響著蜂王漿的品質(zhì)[28-30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，白糖飼喂組的蜂王漿產(chǎn)物中的癸酸顯著低于蜂蜜組，高果糖漿組的蜂王漿產(chǎn)物中的甘油顯著低于蜂蜜組，與白糖組相比較，高果糖漿組的蜂王漿產(chǎn)物中軟脂酸較高。說明不同的糖飼料的蜜蜂蜂王漿產(chǎn)物中脂肪酸的含量有一定差異。

蜜蜂的生長發(fā)育、生命活動(dòng)的進(jìn)行以及蜂產(chǎn)品的生產(chǎn)所需要的能量主要由糖代謝產(chǎn)生，糖類在酶解的作用下水解成葡萄糖和果糖。單糖被吸收到血液中以后，在細(xì)胞脂肪體中合成海藻糖，同時(shí)轉(zhuǎn)化成糖原貯存在細(xì)胞中。然后，蜜蜂機(jī)體內(nèi)通過糖酵解、三羧酸循環(huán)產(chǎn)生三磷酸腺苷從而參與到身體的各項(xiàng)生理活動(dòng)中去[31-32]。本實(shí)驗(yàn)表明不同的糖飼料飼喂對(duì)蜂王漿產(chǎn)物中的糖類含量有一定影響。蜜蜂對(duì)于糖類的需要會(huì)隨著發(fā)育階段所需營養(yǎng)物質(zhì)而不同，它們會(huì)根據(jù)自身需求進(jìn)行選擇來維持機(jī)體均衡[33]。蜜蜂幼蟲期發(fā)育緩慢，對(duì)糖的需要量少，對(duì)于1～4 日齡蜂王幼蟲，所食食物中糖分的提高能夠加大蜂王幼蟲的采食量和速度，促進(jìn)其生長發(fā)育[34]。

由以上可知，不同糖飼料飼喂分泌的蜂王漿中的小分子代謝物質(zhì)存在差異，這種由于不同糖飼料飼喂導(dǎo)致的差異會(huì)對(duì)蜜蜂機(jī)蜜蜂幼蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生一定的影響，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為蜂王漿作為一種保健產(chǎn)品供人們所食用時(shí)，應(yīng)將蜂王漿中對(duì)于人體有利的小分子物質(zhì)作為考慮因素來進(jìn)行實(shí)際生產(chǎn)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新之處也是不足之處在于運(yùn)用GC-QTOF-MS代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)蜂王漿中的代謝物進(jìn)行基礎(chǔ)分析，GC-QTOF-MS代謝組學(xué)技術(shù)由于是新興起的一門檢測技術(shù)，還在不斷完善和發(fā)展，在蜂王漿成分這一方面的檢測圖譜還不夠全面，以致部分小分子物質(zhì)未能檢出，無法比較其差異性，但隨著技術(shù)的不斷完善，利用代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步分析蜂王漿中的代謝物以及代謝途徑，對(duì)于指導(dǎo)蜂農(nóng)飼喂及生產(chǎn)以及蜂王漿的進(jìn)一步研究有一定的理論指導(dǎo)意義。