去折疊態(tài)β-乳球蛋白與表沒食子兒茶素沒食子酸酯的相互作用

付珊琳，鐘俊楨*，姚文俊，覃芳芳，劉成梅，劉 偉

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）是牛奶乳清中一種主要的蛋白質(zhì)，含量占牛乳乳清中蛋白總量的50%。β-LG是分子質(zhì)量約為18.4 kDa的水溶性耐熱球狀蛋白質(zhì)。它由162 個氨基酸殘基組成，通過8 股反向平行的β-折疊鏈構(gòu)成一個β桶（即“calyx”）[1]。β-LG在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性環(huán)境相對不太穩(wěn)定。β-LG作為脂質(zhì)運載蛋白家族的一員，其重要的理化性質(zhì)是可以在體外結(jié)合多種配體，比如β-胡蘿卜素[2]、姜黃素[3]、亞油酸[4]、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）[5]、大蒜素[6]等。

天然多酚類物質(zhì)在植物界中廣泛存在，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑。大量研究表明，多酚類物質(zhì)具有抑菌、增強免疫力、降血脂、預(yù)防動脈硬化等作用[7]。茶多酚就是其中之一，可作為安全的添加劑在食品中廣泛應(yīng)用。兒茶素是茶多酚中的主要物質(zhì)，約為茶多酚總量的70%。其中EGCG是兒茶素中含量最高的多酚，占兒茶素總量的50%左右，是兒茶素抗氧化性的最主要的貢獻(xiàn)者[8]。EGCG在食品體系中，能與食品中的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。Wu Xuli等[9]研究表明，β-LG與EGCG結(jié)合后，其與IgE多克隆抗體和IgG多克隆抗體結(jié)合能力有所降低，致敏性下降。Li Zheng等[10]研究顯示EGCG能與牛血清蛋白形成納米顆粒，改善EGCG的吸收。研究EGCG與蛋白質(zhì)的相互作用有助于了解EGCG與蛋白質(zhì)在食品中的真實狀態(tài)和它們之間的相互影響。

β-LG的功能性質(zhì)很容易被熱、高壓、酶解等處理改變。其與配體的結(jié)合也依賴于與pH值、溫度等環(huán)境因素相關(guān)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和聚合狀態(tài)。Zorilla等[11]研究表明，熱處理的β-LG比天然β-LG與配體的結(jié)合常數(shù)更大，且對配體的保護(hù)效果更好，而這可能是由于熱處理使得β-LG去折疊導(dǎo)致的。但目前關(guān)于去折疊態(tài)β-LG（unfolded-β-LG，U-β-LG）與EGCG相互作用的研究還較少。Gomaa等[12]研究表明，相同溫度條件下，β-LG經(jīng)微波處理能達(dá)到比加熱更好的去折疊效果。因此，本研究參考Gomaa等[12]的方法利用微波處理制備U-β-LG，并采用熒光光譜、紫外-可見光譜、圓二色光譜的光譜學(xué)方法研究U-β-LG與EGCG的相互作用機制，與天然β-LG相比較，考察U-β-LG與EGCG相互作用的差異，探究不同構(gòu)象條件下β-LG與多酚相互作用的機制變化，為改性蛋白與多酚類物質(zhì)自組結(jié)合機制研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛β-L G（純度≥9 0%）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司；EGCG（純度≥98%） 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

NJL07-3型實驗專用微波爐 南京杰全微波設(shè)備有限公司；F-7000熒光分光光度計 日本日立公司；UV-16000PC紫外光譜儀 上海美譜達(dá)儀器有限公司；FiveEasy Plus pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MOS-450光譜儀器 法國French Bio-Logic SAS 公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

用0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 6.8）分別配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的β-LG溶液儲備液和50 mg/mL的β-LG溶液，其中質(zhì)量濃度為50 mg/mL的β-LG溶液用于制備樣品。用0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 6.8）配制濃度為2 mmol/L的EGCG儲備溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 U-β-LG的制備

參考文獻(xiàn)[12]，采用15～300 W之間的微波使β-LG溶液溫度在5 min之內(nèi)達(dá)到80 ℃，并處理10 次。每次結(jié)束后立即放入冷水浴中冷卻到4 ℃。在微波處理后立即測量溶液溫度。制得的樣品即為U-β-LG。樣品置于4 ℃條件下保存。

1.3.3 熒光光譜測定

用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.8）配制β-LG或U-β-LG與EGCG的物質(zhì)的量比為1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10的混合溶液。最終反應(yīng)體系中β-LG或U-β-LG濃度為10 μmol/L。將裝有混合溶液的離心管分別置于288 K水浴反應(yīng)1 h后取出，用熒光分光光度計在與水浴相同溫度條件下檢測熒光強度大小的變化。將配制好的樣品取少量用于潤洗標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，取2 mL樣品于比色皿中進(jìn)行熒光掃描。熒光分光光度計激發(fā)波長為280 nm，掃描發(fā)射光譜范圍為290～450 nm。激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5.0 nm，掃描速率1 200 nm/min。在同樣條件下掃描在298 K和308 K條件下反應(yīng)的熒光光譜。

1.3.4 紫外吸收光譜分析

用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.8）配制β-LG或U-β-LG與EGCG的物質(zhì)的量比為1∶0、1∶5、1∶10的混合溶液。最終反應(yīng)體系中的β-LG或U-β-LG的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.8）配制濃度為10 μmol/L的EGCG溶液。將裝有β-LG或U-β-LG的混合溶液和EGCG溶液的離心管分別置于298 K水浴靜置1 h后取出。裝有β-LG或U-β-LG的混合溶液的紫外吸收光譜波長掃描范圍為200～360 nm，EGCG溶液的紫外吸收光譜波長掃描范圍為290～450 nm，光徑為1 cm，光譜帶寬為2.0 nm，響應(yīng)時間為0.2 s，波長間隔為1.0 nm，測定溫度為298 K。

1.3.5 遠(yuǎn)紫外圓二色光譜

用0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 6.8）將樣品稀釋為蛋白質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的溶液。β-LG或U-β-LG與EGCG的物質(zhì)的量比為1∶0、1∶5、1∶10。將裝有β-LG或U-β-LG的混合溶液的離心管分別置于298 K水浴靜置1 h后取出。配制好的樣品取適量潤洗標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，取1 mL樣品于比色皿，使用MOS-450光譜儀器用于遠(yuǎn)紫外圓二色光譜分析。采用光路長為0.1 cm的圓形石英比色皿，掃描范圍為190～250 nm，掃描步進(jìn)分辨率為1 nm，掃描速率為100 nm/min，譜帶寬度為2.0 nm，測定溫度為298 K。每份樣品重復(fù)掃描3 次，采用DichroWeb在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測二級結(jié)構(gòu)相對含量。

1.3.6 外源性熒光測定

采用ANS熒光探針法測定蛋白質(zhì)的表面疏水性。用0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 6.8）將樣品稀釋為蛋白質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的溶液。β-LG或U-β-LG與EGCG的物質(zhì)的量比為1∶0、1∶5、1∶10。將裝有β-LG或U-β-LG的混合溶液的離心管分別置于298 K水浴靜置1 h后取出。分別取4 mL樣品與20 μL溶于0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 6.8）的8 mmol/L的ANS溶液混合，渦旋振蕩30 s，避光靜置3 min后取2 mL用于測定熒光強度。激發(fā)波長370 nm，發(fā)射波長400～600 nm，掃描速率1 200 nm/min，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為10 nm，測定溫度為298 K。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0軟件在對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），顯著性水平設(shè)定為0.05。所有實驗均重復(fù)3 組，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量數(shù)據(jù)表示為。采用Origin 7.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對β-LG和U-β-LG熒光光譜的影響

酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等發(fā)色基團(tuán)是使蛋白質(zhì)具有內(nèi)源性熒光特性的主要基團(tuán)。β-LG含有2 個色氨酸殘基（Trp19和Trp61）和4 個酪氨酸殘基（Tyr20、Tyr42、Tyr99和Tyr102），是研究β-LG內(nèi)源性熒光變化的主要工具。從圖1可以看出，在298 K時，β-LG和U-β-LG的最大熒光發(fā)射波長（λmax）分別為334 nm和338 nm，并隨著EGCG濃度的增加β-LG和U-β-LG的λmax均有輕微的紅移，熒光強度減小。這說明EGCG能與β-LG或U-β-LG相互結(jié)合，并且使β-LG和U-β-LG的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，色氨酸和酪氨酸的極性增強，疏水性下降[13]。U-β-LG熒光強度大于β-LG的熒光強度可能是由于微波處理使得β-LG發(fā)生去折疊[12]。在EGCG濃度為100 μmol/L時，β-LG和U-β-LG的內(nèi)源性熒光強度分別降低了83.29%和89.56%。這說明EGCG對U-β-LG的猝滅能力比對β-LG的猝滅能力強。這可能是由于EGCG與U-β-LG的相互作用能力更強[14]。

圖1 在不同EGCG濃度條件下測定的β-LG（A）和U-β-LG（B）熒光光譜Fig. 1 Fluorescence spectra of β-LG (A) and U-β-LG (B) at different concentrations of EGCG

2.2 熒光猝滅機制

熒光猝滅可能在不同的機制下發(fā)生，一般可分為靜態(tài)和動態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅時，隨著溫度升高，復(fù)合物穩(wěn)定性會下降，猝滅常數(shù)降低。而動態(tài)猝滅是由于猝滅劑分子的擴散和碰撞導(dǎo)致，隨著溫度升高，猝滅常數(shù)會增大。在288、298 K和308 K條件下，β-LG和U-β-LG與EGCG之間的猝滅效率可通過Stern-Volmer方程[15]（1）分析：

式中：F0為沒有淬滅劑（EGCG）存在條件下的熒光強度；F為淬滅劑（EGCG）存在時的熒光強度；Kq為雙分子淬滅過程的速率常數(shù)/（L/（mol·s））；τ0為淬滅劑不存在時的熒光分子的平均熒光壽命/s；Ksv為動態(tài)淬滅常數(shù)/（L/mol）；[Q]為淬滅劑濃度/（mol/L）。

圖2 不同溫度條件下β-LG（A）和U-β-LG（B）與EGCG相互作用的Stern-Volmer曲線Fig. 2 Stern-Volmer plots for quenching of β-LG (A) and U-β-LG (B)by EGCG at different temperatures (pH 6.8)

表1 不同溫度條件下的EGCG與β-LG和U-β-LG的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Quenching and binding constants and thermodynamic parameters for interactions between β-LG or U-β-LG and EGCG at different temperatures

根據(jù)Stern-Volmer方程（1），以F0/F為縱坐標(biāo)，Q為橫坐標(biāo)作圖，如圖2所示。β-LG和U-β-LG的Stern-Volmer曲線均為非直線關(guān)系。這說明EGCG對β-LG和U-β-LG的內(nèi)源熒光的猝滅都不是主要由動態(tài)猝滅導(dǎo)致的，而可能是因為EGCG與β-LG和U-β-LG之間形成不發(fā)光的復(fù)合物或者動態(tài)和靜態(tài)猝滅共同導(dǎo)致的[16-17]。如表1所示，β-LG的Ksv隨著溫度的升高而增大，U-β-LG的Ksv隨著溫度的升高先減小后增大。所以可能是在猝滅過程中最初是動態(tài)猝滅，但是靜態(tài)猝滅也可能存在于EGCG和β-LG或U-β-LG的體系中[18-19]。由于β-LG和U-β-LG的Kq顯然均大于擴散和碰撞導(dǎo)致的猝滅的最大擴散猝滅常數(shù)（2×1010L/（mol·s）），所以EGCG對β-LG和U-β-LG的猝滅機制主要是靜態(tài)猝滅[20]。

2.3 紫外-可見吸收光譜分析

紫外-可見吸收光譜法是一種檢測結(jié)構(gòu)變化和測定復(fù)合物形成的簡單有效的方法[21]。通常，最強吸收峰（約214 nm）反映的是蛋白質(zhì)分子的肽鏈，弱吸收峰（約280 nm）主要是包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸在內(nèi)的芳香族氨基酸的吸收峰[22]。為進(jìn)一步判斷EGCG對β-LG和U-β-LG的猝滅方式，測定EGCG與β-LG和U-β-LG的物質(zhì)的量比為0∶1，5∶1，10∶1時的紫外吸收光譜。從圖3可以看出，β-LG和U-β-LG分別與EGCG結(jié)合前后的吸收光譜并沒有發(fā)生重疊，形成了新的紫外光譜。隨著EGCG濃度的增加，在β-LG和U-β-LG的最大吸收波長處吸收強度降低，最大吸收波長紅移，位于278 nm波長處的吸收強度也隨著EGCG濃度的增加而增大。這表明EGCG分別與β-LG和U-β-LG發(fā)生相互作用，引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，形成復(fù)合物[22]。并進(jìn)一步說明EGCG對β-LG和U-β-LG都主要是靜態(tài)猝滅[23-24]。這與β-LG和U-β-LG的熒光光譜結(jié)果一致。U-β-LG在最大吸收波長處和278 nm處的吸收強度都大于β-LG，可能是由于β-LG在微波處理之后發(fā)生了去折疊[12]，三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖3 不同濃度EGCG與β-LG或U-β-LG的紫外吸收光譜Fig. 3 UV absorbance spectra of β-LG and U-β-LG in the presence of different concentrations of EGCG

2.4 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

對于靜態(tài)猝滅，假設(shè)在蛋白質(zhì)上有多個獨立的結(jié)合位點，則配體和蛋白質(zhì)之間的相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)可以通過方程式（2）[25]求得：

式中：Ka為結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；n為每個蛋白分子可能的結(jié)合位點數(shù)。

圖4 不同溫度條件下β-LG（A）和U-β-LG（B）與EGCG相互作用的雙對數(shù)回歸曲線Fig. 4 Double logarithmic regression curves for interaction of EGCG with β-LG (A) and U-β-LG (B) at different temperatures (pH 6.8)

根據(jù)方程式（2），以lg[（F0－F）/F]為縱坐標(biāo)，lg[Q]為橫坐標(biāo)作圖，得到EGCG對β-LG和U-β-LG熒光猝滅的雙對數(shù)曲線，如圖4所示。在288、298 K和308 K條件下，EGCG與β-LG和U-β-LG之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)列于表1。結(jié)合常數(shù)越大表明配體與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合力越強。在同一溫度條件下，U-β-LG的結(jié)合常數(shù)均大于β-LG的結(jié)合常數(shù)，這表明EGCG與U-β-LG的結(jié)合強度大于β-LG。隨著溫度的升高，β-LG和U-β-LG的結(jié)合常數(shù)都增大，這說明EGCG與β-LG或U-β-LG之間存在共價形式的相互作用，但是其中主要還是非離子形式存在的相互作用[9]。溫度可能會影響到EGCG-β-LG和EGCG-U-β-LG 體系的擴散系數(shù)和穩(wěn)定性。溫度升高會導(dǎo)致擴散系數(shù)增大，并使得EGCG-β-LG和EGCG-U-β-LG體系的穩(wěn)定性降低。隨著溫度的升高，EGCG-β-LG和EGCG-U-β-LG體系的擴散系數(shù)和穩(wěn)定性之間的競爭可能就是導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)增大的原因[26]。在288、298 K和308 K條件下，EGCG與U-β-LG的結(jié)合位點數(shù)均大于β-LG，這可能是由于微波處理使得β-LG去折疊，暴露出了部分原本隱藏著的結(jié)合位點[27]。

2.5 熱力學(xué)參數(shù)

氫鍵、范德華力、疏水作用力、靜電相互作用等是配體與蛋白質(zhì)之間的主要非共價作用力。有研究表明，蛋白質(zhì)-配體之間的非共價力可以依據(jù)熱力學(xué)參數(shù)焓變值（ΔH）和熵變值（ΔS）進(jìn)行表征：當(dāng)ΔH小于0、ΔS小于0時，分子間的作用力主要是氫鍵、范德華力或質(zhì)子化等作用；當(dāng)ΔH大于0、ΔS大于0時，分子間的作用力主要是疏水作用力；當(dāng)ΔH小于0、ΔS大于0時，分子間的作用力主要是靜電引力；當(dāng)ΔH大于0、ΔS小于0時，分子間的作用力主要是疏水作用力和靜電引力[14]。吉布斯自由能（ΔG）、焓變值和熵變值這些熱力學(xué)參數(shù)可以通過Van’t Hoff方程[14]（3）、（4）計算得到：

式中：R為氣體常數(shù)8.314 J/（mol·K）；T為實驗溫度/K；Ka為在相應(yīng)的溫度（288、298 K和310 K）條件下的結(jié)合常數(shù)/（L/mol）。

如表1所示，EGCG與β-LG或U-β-LG的結(jié)合反應(yīng)ΔG都為負(fù)值，說明EGCG與這2 種蛋白質(zhì)的結(jié)合過程都是自發(fā)進(jìn)行的；EGCG與β-LG或U-β-LG的ΔH和ΔS都為正數(shù)，說明EGCG與這2 種蛋白質(zhì)間的作用力主要為疏水作用力。

2.6 能量轉(zhuǎn)移和結(jié)合距離

EGCG對β-LG或U-β-LG的熒光猝滅可能是結(jié)合的EGCG與β-LG和U-β-LG之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)F?ster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的熒光發(fā)射光譜與配體的吸收光譜有足夠的重疊，而且蛋白質(zhì)與配體的最大距離不超過7 nm，則配體與蛋白質(zhì)的能量轉(zhuǎn)移效率（E）和結(jié)合距離（r）可通過關(guān)系式[16]（5）～（7）計算：

式中：R0為轉(zhuǎn)移效率為50%時從配體到蛋白質(zhì)的F?ster臨界能量轉(zhuǎn)移距離/nm；r為結(jié)合的配體與蛋白質(zhì)之間的距離/nm；K2為配體、蛋白質(zhì)的空間取向因子（K2=2/3）；N為介質(zhì)的平均折射指數(shù)（N=1.359 8）；Φ為蛋白質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率（Φ=0.15）；J為蛋白質(zhì)的熒光發(fā)射光譜與配體的吸收光譜之間的光譜重疊積分/（（cm3·L）/mol）；F（λ）為蛋白質(zhì)在波長為λ的熒光強度；ε（λ）為配體在波長λ時的摩爾吸光系數(shù)/（L/（mol·cm））。

圖5 β-LG（A）和U-β-LG（B）的熒光光譜與EGCG的吸收光譜Fig. 5 Overlapping emission spectra and absorption spectra of β-LGEGCG complex (A) and U-β-LG-EGCG complex (B)

表2 298 K時的F?ster非輻射能量轉(zhuǎn)移參數(shù)Table 2 Parameters of F?rster non-radiation energy transfer at 298 K

根據(jù)圖5計算得到298 K時EGCG與β-LG或U-β-LG的F?ster非輻射能量轉(zhuǎn)移參數(shù)，如表2所示?？芍狤GCG到β-LG或U-β-LG的距離均在2～7 nm之間，這進(jìn)一步說明EGCG對β-LG或U-β-LG的內(nèi)源熒光的猝滅相較于動態(tài)猝滅更可能是靜態(tài)猝滅[28]。而EGCG到U-β-LG的距離小于到β-LG的距離，可能是由于微波處理的β-LG發(fā)生了去折疊，使得原本隱藏的結(jié)合位點暴露了出來，導(dǎo)致結(jié)合距離變小。

2.7 遠(yuǎn)紫外圓二色光譜分析

圖6 β-LG和U-β-LG在不同濃度EGCG條件下的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜圖Fig. 6 Far-UV circular dichroism spectra of 0.1 mg/mL β-LG and U-β-LG in the presence of different concentrations of EGCG

表3 β-LG和U-β-LG與不同物質(zhì)的量比的EGCG結(jié)合的二級結(jié)構(gòu)相對含量Table 3 Secondary structure contents of β-LG and U-β-LG upon interaction with EGCG in different molar ratios of ligand to protein

如圖6所示，不同濃度EGCG存在條件下的β-LG在180～200 nm有一正譜帶，在216～218 nm有一個負(fù)峰，這是β-折疊結(jié)構(gòu)的典型特征；不同濃度EGCG存在條件下的U-β-LG在192 nm附近有一個正吸收峰，在208 nm和222 nm附近有負(fù)的吸收峰，這是α-螺旋的典型特征。β-LG和U-β-LG二級結(jié)構(gòu)的相對含量由DichroWeb程序得到，如表3所示。微波處理的U-β-LG的β-折疊相對含量顯著少于β-LG，α-螺旋大于β-LG（P＜0.05），這進(jìn)一步證明了微波處理使得β-LG發(fā)生了去折疊。加入EGCG后，U-β-LG的α-螺旋相對含量均增加，β-折疊相對含量都減少，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的相對含量之和減少。而EGCG引起的β-LG的二級結(jié)構(gòu)變化不明顯。這說明在與EGCG結(jié)合的過程中，配體誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)變化是在結(jié)合位點附近的局部變化，不涉及到蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性的顯著變化[29-30]。相較于EGCG對β-LG二級結(jié)構(gòu)的影響，可以檢測到EGCG存在時U-β-LG更多的變化，這可能是由于EGCG與U-β-LG的相互作用更強[30]。這與內(nèi)源性熒光的檢測結(jié)果相符。

2.8 外源性熒光光譜分析

圖7 不同濃度EGCG對β-LG或U-β-LG的表面疏水性的影響Fig. 7 Surface hydrophobicity of β-LG and U-β-LG in the presence of different concentrations of EGCG

蛋白質(zhì)表面疏水性是蛋白質(zhì)的表面與極性水溶液環(huán)境相接觸的疏水基團(tuán)的參數(shù)。β-LG的表面疏水性大小是通過其表面的疏水性氨基酸與ANS形成的結(jié)合物的熒光強度表示。如圖7所示，微波處理U-β-LG的熒光強度大于β-LG的熒光強度，且發(fā)生了輕微藍(lán)移，這可能是微波處理后β-LG發(fā)生了去折疊，β-LG分子間的疏水作用遭到了破壞，暴露出了更多的β-LG內(nèi)部疏水基團(tuán)，從而增加了β-LG的表面疏水性[31]。而EGCG與β-LG和U-β-LG之間的作用力主要是疏水作用力，這可能是EGCG與U-β-LG的結(jié)合能力更高的原因。隨著EGCG濃度的增大，β-LG和U-β-LG的熒光強度均減小，表面疏水性降低。這與內(nèi)源性熒光的結(jié)果相一致。可能是由于EGCG與β-LG或U-β-LG通過疏水作用結(jié)合后形成的復(fù)合物破壞了β-LG和U-β-LG原本的疏水結(jié)構(gòu)[20]，降低了它們與ANS結(jié)合的能力。而U-β-LG與EGCG的結(jié)合能力比β-LG強可能是導(dǎo)致U-β-LG熒光強度降低程度小于β-LG的原因。

3 結(jié) 論

本研究通過光譜學(xué)方法研究EGCG與微波處理得到的U-β-LG的相互作用機制，并與天然β-LG相比較。結(jié)果表明，EGCG與U-β-LG主要是通過疏水作用力形成復(fù)合物。相較于天然β-LG，β-LG去折疊可以使蛋白質(zhì)與EGCG的結(jié)合強度增大，結(jié)合位點增多，結(jié)合距離變小。在與EGCG結(jié)合的過程中，U-β-LG的二、三級結(jié)構(gòu)變化大于天然β-LG，但是配體誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)變化是在結(jié)合位點附近的局部變化，不涉及到蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性的顯著變化。微波導(dǎo)致的蛋白質(zhì)去折疊有利于蛋白質(zhì)與配體的相互作用。