5種靈芝菌株的農藝性狀、活性成分和功效分析

金 鑫，周思菊，李 強，李 萍，譚 偉，李小林，黃文麗*

（1.四川省農業(yè)科學院生物技術核技術研究所，成都610061；2.桂林市農業(yè)科學院，廣西桂林541006；3.四川省農業(yè)科學院土壤肥料研究所，成都610066）

靈芝（Ganoderma lucidum）隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales）、靈芝科（Ganodermataceae）[1]，是我國的名貴中藥材?！渡褶r本草經》和《本草綱目》認為靈芝具有益氣強身、扶正固本、延年益壽等功效?，F(xiàn)代藥理學研究證實靈芝含有如靈芝多糖和三萜類化合物等活性成分，具有調節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老、保肝護肝、治療心腦血管疾病等作用[2-3]。我國是世界靈芝的主要生產國和出口國，靈芝品種篩選研究也是中國食用菌種業(yè)研究的重要內容[4]。我國市場上栽培靈芝品種較多，不同靈芝品種的農藝性狀和轉化率及其活性成分含量和藥效品質均有差異[5]。因此，本研究以5個不同來源的靈芝菌株為研究對象，對靈芝外觀性狀、色澤等農藝性狀及轉化率、多糖、三萜等活性成分和抗氧化作用和促進脾細胞增殖能力等進行了測試分析，為靈芝產品的開發(fā)和靈芝種業(yè)研究提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

金地靈芝（簡稱JD，登錄號：MF476197）和黃靈芝（簡稱HLZ，登錄號：MF476199）來自四川省農業(yè)科學院，平芝（簡稱PZ，登錄號：MF476201）和圓芝8號（簡稱YZ8，登錄號：MF476198）來自駐馬店農業(yè)科學研究所，靈白（簡稱LB，登錄號：MF476200）來自泰安市農業(yè)科學研究院。

1.1.2 栽培管理

試驗在四川省德陽市食用菌專家大院進行，栽培時間為2015年1—6月。首先選取直徑10～15 cm青岡樹，截成15 cm長的小段木通過裝袋、滅菌、接種，將接種完的菌袋全部搬入培養(yǎng)室內，溫度控制在25～28℃，濕度控制在60%～70%。4月上旬將發(fā)菌培養(yǎng)好的菌棒進行脫袋覆土栽培，原基生長階段控制濕度在85%～95%，溫度控制在25～30℃，菌柄生長階段和菌蓋生長階段控制濕度90%～95%，溫度控制在28～30℃，子實體成熟期降低濕度到80%～85%，溫度控制在25～30℃，子實體白色邊緣消失并開始噴射孢子粉時表明進入成熟期，此時即采收同時進行數據測量。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集、農藝性狀測定

采收后的子實體分別用游標卡尺測定靈芝子實體菌蓋直徑、菌蓋厚度和菌柄長度，并計算轉化率：轉化率=（干產量/鮮段木重）×100%，分別隨機選取30朵子實體作為試驗樣品，將樣品子實體完全烘干至恒重，粉碎過篩孔尺寸為0.18 mm的篩備用。

1.2.2 多糖提取測定

稱取30 g靈芝樣品，以蒸餾水為提取溶劑，料液體積比1∶60，100℃浸提1 h，浸提2次，合并濾液，繪制標準曲線，再通過苯酚硫酸法測定多糖含量[6]。

1.2.3 三萜提取測定

稱取20 g靈芝樣品，按1∶20的料液體積比加入95%的乙醇，攪拌混勻后，300 W（30%）超聲1 h，超聲完成后浸泡8 h，抽濾獲得靈芝三萜提取液。以熊果酸為標準品，采用香草醛-冰醋酸法測定三萜含量[7]。精確移取樣品0.1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入新制的香草醛-冰醋酸溶液0.6 mL，再加入1.2 mL的濃硫酸搖勻，于70℃恒溫水浴上保溫反應30 min，流水冷卻至室溫，再加入冰醋酸定量到10 mL，搖勻。同時做空白對照，在552 nm處測定體系的吸光度。

1.2.4 不同品種靈芝的抗氧化活性測定

不同品種的靈芝經粉碎后，按照1.2.2獲得多糖提取物，提取物經旋轉蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥后備用。進行清除DPPH自由基能力測定[8]，超氧自由基（O2-）清除率測定[9]，羥自由基（·OH）清除率的測定[10]。

1.3 不同品種靈芝對脾細胞的增殖作用

1.3.1 脾細胞懸液制備

對SPF級6 W齡（18～22 g）的BALB/C小鼠進行無菌取脾，置于盛有適量（3～5 mL）無菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內芯輕輕將脾磨碎，制成單個細胞懸液。經篩孔尺寸為0.075 mm的篩網過濾，用Hank's液洗2次，每次離心10 min（1 000 r/min）。然后將細胞懸浮于2 mL的完全培養(yǎng)液中，用全自動細胞計數儀計數脾細胞，調整細胞濃度為3×106個/mL。

1.3.2 淋巴細胞增殖反應

將細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，每孔加75 mL ConA液（相當于7.5μg/mL），加入不同濃度的靈芝多糖提取物（0.05、0.1、0.5、1 mg/mL）100μL，以緩沖液替代靈芝提取物作為陰性對照，未加細胞的孔作為空白對照。置5%CO2，37℃CO2孵箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入MTT（5 mg/mL）50μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，超聲震蕩（2 s）或人工吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔分裝3孔作為平行樣，用酶聯(lián)免疫檢測儀，以570 nm波長測定OD值。

表1 不同靈芝菌株子實體農藝性狀及轉化率比較Table 1 Comparison of agronomic characters and conversion rateof different Ganodermalucidum strains

1.4 數據處理

試驗測定的數據結果全部用±s表示，用SPSS17.0軟件對結果進行t檢驗統(tǒng)計學處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同靈芝菌株子實體農藝性狀及轉化率分析

從表1可以看出，5個靈芝菌株其子實體的菌蓋直徑、菌蓋厚度和菌柄長度相互間存在較大差異。黃靈芝（HLZ）的菌蓋直徑最大達到（17.42±1.03）cm，其次為圓芝8號，金地靈芝（JD）的菌蓋直徑最小僅為（8.76±1.20）cm，5個靈芝的菌蓋直徑相互間存在顯著差異（P＜0.05）；黃靈芝和圓芝8號（YZ8）靈芝菌蓋厚度較大，二者間不存在顯著差異（P＞0.05），金地靈芝的菌蓋最??；在菌柄長度上，金地靈芝和圓芝8號菌柄較長，兩者間不存在顯著差異（P＞0.05），黃靈芝菌柄最短；圓芝8號的轉化率最高達到1.64%，其次為黃靈芝1.58%，最低的為金地靈芝，其轉化率為0.64%。從下圖1中可以看出，金地靈芝生長整齊度表現(xiàn)一般，有單朵生長也有連芝現(xiàn)象，黃色邊緣尚未全部消失就有孢子粉彈出；黃靈芝出芝最晚且稀疏，分支較少，在菌蓋生長階段其邊緣為黃色，單朵菌蓋直徑最大，且菌蓋較厚，干產量轉化率也較高，綜合表現(xiàn)較好；平芝（PZ）菌株出芝最早，成熟時間短，菌蓋邊緣較平展，分芝較多，菌柄短，產孢量較其他品種多；圓芝8號出芝較整齊，不易分支，色澤較好，成熟時背面為金黃色，子實體外觀整齊，單朵菌蓋成腎型；靈白（LB）菌株出芝整齊度最差，在菌蓋分化階段，其菌蓋邊緣為白色，易分支，菌蓋厚度較小。綜合子實體農藝性狀和轉化率可以看出圓芝8號菌株表現(xiàn)最好，適合進行推廣種植。

2.2 靈芝水提液中活性成分含量比較

從圖2中可以看出5個靈芝菌株其子實體多糖含量在1.82%～2.1%之間，PZ最高達到2.1%，YZ8最低為1.82%，HLZ和JD、LB、YZ8存在差異顯著（P＜0.05），具體順序為HLZ＞PZ＞JD＞LB＞YZ8。從圖3中可以看出5個靈芝菌株其子實體三萜含量在0.84%～1.06%之間，最高的為JD，其次為PZ，而含量最低的為YZ8，僅為0.84%；JD和PZ兩者之間不存在顯著差異（P＞0.05），它們與HLZ、LB、YZ8存在顯著差異（P＜0.05）?？芍圆煌撵`芝菌株通過相同的栽培材料和栽培方法其子實體內活性成分存在較大差異。結果顯示，以多糖為目標進行菌株篩選，HLZ為最佳菌株；以三萜為目標進行菌株篩選，JD為最佳菌株。

2.3 不同靈芝子實體抗氧化能力比較

以5個不同靈芝子實體為原料，分析它們的抗氧化能力，對其水提物的DPPH清除率、羥自由基清除率、超氧自由基清除率進行相互比較，以Vc為對照。從圖4結果中發(fā)現(xiàn)，5個靈芝子實體均具有較強的清除DPPH能力，其清除能力范圍在0.945～0.969之間，各菌株之間沒有明顯的差異（P＞0.05），均與Vc相當。羥自由基清除率結果如圖5，清除能力范圍在0.234～0.629之間，存在顯著差異（P＜0.05），清除能力最強的為HLZ，最低為PZ，JD、HLZ、YZ8這3種靈芝清除羥自由基的能力比Vc強，PZ和LB較Vc弱。從圖6超氧自由基清除率結果看出，5種靈芝的清除能力范圍在0.455～0.550之間，清除能力都較Vc弱，PZ和YZ8清除能力較強，二者間不存在顯著差異，JD、HLZ和LB三者間不存在顯著差異（P＞0.05），但與PZ和YZ8存在顯著差異（P＜0.05），具體清除率順序為Vc＞YZ8＞PZ＞HLZ＞LB＞JD。綜合得出HLZ和YZ8對自由基的清除能力較JD、PZ和LB強。

圖1 段木栽培子實體圖Figure 1 Fruiting bodies of cut-log cultivation

圖2 不同靈芝菌株其子實體多糖含量Figure 2 Polysaccharide content of different Ganoderma lucidum strains

圖3 不同靈芝菌株其子實體三萜含量Figure 3 Triterpenoids content of different Ganoderma lucidum strains

2.4 不同靈芝子實體促進脾細胞增殖作用

5個靈芝子實體為原料，以水提液中多糖濃度為變量，比較分析不同濃度多糖靈芝水提液體外給藥對免疫細胞功能的影響。從圖7結果中可以看出，JD、HLZ、LB、YZ8其對脾細胞的增殖作用隨著濃度的不斷提高，脾細胞的增殖先降低后升高，而PZ對脾細胞的增殖作用隨著濃度的不斷提高，其增殖作用隨之提高。HLZ、YZ8在水提液多糖濃度從0.1 mg/mL提高到0.5 mg/mL時，其增殖作用明顯增強，LB在水提液多糖濃度為0.05 mg/mL時其增殖作用最強，濃度越高其增殖作用反而變弱了。5個靈芝子實體水提液多糖濃度為0.05 mg/mL時，LB增殖作用最強，PZ最低；水提液多糖濃度為0.10 mg/mL時，其A700值與水體系相當，故其還原能力最弱[11]，5個靈芝菌株子實體的增殖作用相互之間不存在顯著差異；水提液多糖濃度為0.50 mg/mL時，HLZ增殖作用最強，PZ最低；JD、HLZ、LB和YZ8這4個靈芝菌株其子實體水提液多糖濃度在0.50 mg/mL和1.00 mg/mL時其脾細胞增殖作用相互間不存在顯著差異（P＞0.05），PZ的不同濃度水提液對脾細胞的增殖作用相互間存在顯著差異（P＜0.05）。

圖4 不同靈芝子實體水提物對DPPH的清除率Figure 4 Scavenging rate of DPPH in aqueous extract of Ganoderma lucidum

圖5 不同靈芝子實體水提物對羥自由基的清除率Figure 5 Scavenging rates of hydroxyl radicals from aqueous extracts of different Ganoderma lucidum

圖6 不同靈芝子實體水提物對超氧自由基的清除率Figure 6 Scavenging rates of supernatant free radicals from aqueous extracts of different Ganoderma lucidum

圖7 不同靈芝子實體水提物濃度對脾細胞的增殖作用Figure 7 Effect of aqueous extract of Ganoderma lucidum on the proliferation of spleen cells

3 討論與結論

本研究對5種靈芝菌株的子實體農藝性狀、轉化率、活性成分、抗氧化能力以及對脾細胞的增殖作用進行了分析。

3.1 靈芝子實體農藝性狀及轉化率分析

目前，市場上栽培的靈芝主要以子實體農藝性狀和轉化率為依據進行分析[12]，如林興生等[13]對10個赤芝通過段木栽培模式進行栽培特性分析，發(fā)現(xiàn)雖然在分類學名上統(tǒng)稱為赤芝然其栽培特性差異較大，其中菌株8、新6產量高，子實體農藝性狀較好。王慶武等[14]通過代料栽培模式對17個靈芝菌株進行農藝性狀分析，發(fā)現(xiàn)各靈芝菌株其芝片形狀、芝柄、轉化率差異較大，靈芝泰山-4耐二氧化碳適宜做盆景，靈芝P1產量高適合大面積推廣。本研究對5個靈芝菌株進行段木栽培，分別從子實體農藝性狀和轉化率進行分析，發(fā)現(xiàn)不同的靈芝菌株其子實體外觀形狀、色澤、產孢量和出芝整齊度差別較大，如以子實體的農藝性狀和干產量轉化率為指標，圓芝8號菌株表現(xiàn)最好，較適合推廣種植。

3.2 子實體活性成分含量分析

靈芝多糖和三萜類化合物是靈芝的主要活性成分，逐漸成為衡量靈芝品質的一個重要指標[15-16]。有較多學者對不同靈芝的多糖和三萜化合物含量進行研究，周連玉等[17]對8個靈芝菌株通過代料栽培進行子實體產量和多糖含量研究，發(fā)現(xiàn)各靈芝子實體產量和多糖含量存在顯著差異，并且產量高的菌株其多糖含量不一定高。齊川等[18]通過對11個靈芝子實體活性成分測定分析，結果顯示不同靈芝品種子實體均含有較高總多糖和總三萜，然而它們之間的含量均存在顯著差異，有的品種其多糖含量較高，但三萜含量卻較低，其子實體內多糖和三萜含量不存在協(xié)同相關性。付立忠等[19]通過對12個不同靈芝菌株子實體進行多糖和三萜含量分析，發(fā)現(xiàn)不同靈芝菌株子實體的多糖和三萜含量存在較大差異。本研究對5個靈芝菌株子實體進行多糖和三萜化合物含量分析，發(fā)現(xiàn)不同的靈芝菌株通過相同的栽培材料和栽培方法其子實體內活性成分存在較大差異，多糖含量高的菌株其三萜化合物含量反而低，這一結果與前人研究結果類似。

3.3 子實體活性成分抗氧化能力分析

靈芝的抗氧化作用一直是學術界的熱門研究課題，大量研究結果表明靈芝具有較強的抗氧化能力。Pan K.等[20]的研究結果表明靈芝對胃癌大鼠具有免疫調節(jié)作用以及抗氧化清除自由基作用，Tie L.等[21]發(fā)現(xiàn)靈芝多糖能抑制糖尿病小鼠皮膚的Mn-SOD硝化，增強Mn-SOD和GPX活性，抑制氧化還原酶P66ShC的表達和磷酸化，Jia J.等[22]研究結果顯示靈芝多糖能夠使大鼠體內抗氧化酶量和胰島素含量顯著升高，同時降低脂質過氧化作用和血糖含量，可見靈芝多糖是一種有效的抗氧化物。聶健等[23]研究7個不同靈芝菌株的熱水提取物的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)各種靈芝子實體熱水提取物均有不同程度的體外抗氧化能力，同一濃度下不同靈芝菌株的體外抗氧化能力差異較大。曹正等[24]研究不同靈芝的功能性成分含量和抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)不同品種間的活性成分含量差異較大，活性成分含量高的菌株其抗氧化能不一定高，同一菌株的活性成分濃度越高其抗氧化能力越高。楊德等[25]研究發(fā)現(xiàn)多糖濃度與清除羥基自由基和超氧陰離子的能力呈正相關。張志軍等[26]研究表明靈芝具有較強的抗氧化活性和清除自由基的能力，且多糖濃度越高其抗氧化能力越強，二者有一定的依賴性；董揚[27]等研究同樣表明抗氧化活性與多糖質量濃度呈一定效量關系，多糖質量濃度越高，抗氧化活性越強。本研究對5個靈芝菌株的抗氧化能力進行比較發(fā)現(xiàn)，不同的靈芝菌株其抗氧化能力差異較大，這一結果與前人研究相似，5個靈芝菌株的抗氧化能力都很強，總體上HLZ的抗氧化能力最強，YZ8次之。大量研究結果顯示靈芝水提液具有很強的抗氧化能力，但其能力強弱并不僅僅由多糖和三萜化合物總含量控制，可能還有很多其他物質共同起作用，這里需要更進一步研究，而且多糖和三萜類化合物的種類、結構、分子量也與其功能密切相關，以至于具體的哪種活性物質起主導作用以及它的作用機制還需要更深一步的研究。

3.4 子實體活性成分增免疫分析

脾臟是動物機體最主要的免疫器官之一，是機體發(fā)揮防御功能的重要器官，脾臟指數可作為反映動物機體免疫機能的客觀指標之一[28]，靈芝活性物質多糖能顯著刺激小鼠脾淋巴細胞的增殖作用，增強Con A誘導的淋巴細胞增殖。從本研究的試驗結果可以看出，5個靈芝子實體活性物質多糖能顯著提高脾細胞的增殖作用，多糖濃度越高，脾細胞的增殖作用越強。這一結果與較多學者的研究結果相似，如鄒佳妤等[29]研究報道隨著多糖濃度的增加脾臟指數也隨之增加，二者呈現(xiàn)一定的量效相關性，丁佩娥等[30]研究報道靈芝多糖能顯著促進小鼠脾細胞的增殖反應，且在一定范圍內呈濃度依賴趨勢。這些結果都表明靈芝多糖能促進脾腺的組織分化和細胞增生，促進免疫器官的發(fā)育，增加脾腺免疫器官的重量，增大免疫指數。由此可見，靈芝多糖能顯著提高機體的免疫力，在一定濃度范圍內，多糖濃度越高其免疫力越強。另外，從本研究結果還可以看出不同的靈芝菌株其對脾細胞的增殖作用差距較大，HLZ的增殖作用最強，PZ最低。

目前市場上廣泛栽培的靈芝品種非常多，由于靈芝菌種活性退化較快，優(yōu)質高產菌株篩選一直是育種工作者的重點內容。隨著人們消費觀念的變化，消費者不再只重視其外觀品質而對其藥效保健作用更加關注，因而，對如何提高靈芝活性成分的產量成為現(xiàn)在人們致力研究的重點問題。大量研究學者發(fā)現(xiàn)不同的靈芝菌株通過相同的栽培原料、相同的栽培方式，其子實體內活性成分含量差異較大，因此，通過篩選出高活性高產量的靈芝菌株成為行之有效的途徑之一。